醫學生物化學與分子生物學實驗技術(第2版)（簡體書）

本教材介紹了生物化學與分子生物學的常用實驗技術，包括大分子制備技術、分光光度技術、層析技術、電泳技術、離心技術、分子雜交技術、 PCR技術、測序技術、轉基因技術、基因敲除技術、蛋白質組學技術、 EMSA和 ChIP技術、酵母雙雜交技術等，以及實驗技術的發展簡史、技術創新、實驗室管理等內容。在介紹技術的同時還配有相應的實驗，以供學生在系統了解有關技術的同時進行實驗練習。本教材既可以自成體系、獨立成課使用，也可以與理論教材配套使用；既可以作為實驗教材，也可以作為考研的復習材料。本教材的主要對象為醫學院校各專業的本科生，也可供其他類型院校的學生參考使用。

近年來，生物化學與分子生物學實驗技術發展很快，使得該領域不斷有新的發現。實驗課也普遍受到重視，不僅增加了學時，而且單獨開課，單獨計算學分。實驗課已不再是理論課的附屬品，而是培養學生創新思維的有效途徑。為了幫助醫學生更好地學習掌握生物化學與分子生物學實驗技術，我們編寫了這本實驗教材。全書共計 16章，以實驗技術為主線編寫，主要介紹大分子制備技術、分光光度技術、層析技術、電泳技術、離心技術、分子雜交技術、 PCR技術、測序技術、轉基因技術、基因敲除技術、蛋白質組學技術、 EMSA和 ChIP技術、酵母雙雜交等技術，另外還介紹有關技術創新和實驗室管理等內容。這些內容基本反映了生物化學與分子生物學實驗技術的大體面貌。在介紹實驗技術的同時，還編寫了一些實驗項目，以方便學生通過實驗練習更好地理解掌握有關技術。

第 1章 如何在分子水平研究生命 ....... 1第 1節分子實驗技術簡史 ...................... 1第 2節分子實驗技術體系...................... 4一、生物分子的分析鑒定 ...................4二、生物分子的人工合成 ...................5三、生物分子的人工改造 ...................5四、生物分子的功能研究 ...................6第 3節分子實驗技術應用 ...................... 7一、電泳技術在臨床檢驗中的應用...............................................7二、 DNA重組技術在醫藥衛生領域的擴展 ...................................7三、基因診療技術在未來醫學的前景...............................................8四、動物模型在醫學研究中的重要地位.........................................................9第 2章 從組織中分離純化生物大分子——大分子制備技術 .......... 10第 1節材料預處理及細胞的分離 ........ 11一、選擇材料及預處理 .....................11二、細胞的分離 .................................11第 2節細胞破碎及細胞器分離 ............ 12一、細胞的破碎 .................................12二、細胞器的分離 .............................13第 3節大分子的分離純化與測定 ........ 13一、蛋白質的分離純化 .....................13二、核酸的分離純化 .........................14三、蛋白質濃度的測定 .....................15四、核酸的濃度、純度及完整性測定 .............................................17第 4節生物大分子提純后的處理 ........ 18一、大分子樣品的濃縮 .....................18二、大分子樣品的干燥 .....................18三、大分子樣品的保存 .....................19第 5節實驗練習 .................................... 20一、蛋白質的鹽析與透析 .................20二、蛋白質含量測定 ........................21第 3章 測定物質的吸收光譜——分光光度技術 .................................... 24第 1節 分光光度技術的基本原理 ........ 24一、光的性質 .....................................24二、光譜 .............................................25三、 Lambert-Beer定律 .....................26第 2節 分光光度計的基本結構 ............ 27一、光源 .............................................28二、分光系統 .....................................28三、樣品室 .........................................29四、檢測器 .........................................29五、顯示器 .........................................30第 3節 常用分光光度計的使用方法 .... 30一、 721型分光光度計 ......................30二、 721e型分光光度計 ....................31三、 722s型分光光度計 ....................31四、 SP-756紫外 -可見分光光度計 ...31第 4節 分光光度技術的應用 ................ 31一、溶液的定性分析 .........................32二、溶液的定量分析 .........................32第 5節 實驗練習 .................................... 33一、蛋白質的定量測定 .....................33二、脲酶 Km值測定 ..........................37 三、血清丙氨酸氨基轉移酶活性測定（賴氏法） ...........................40四、血糖的定量測定（葡萄糖氧化酶法） ................................42五、激素對血糖濃度變化的影響 .....43六、血漿高密度脂蛋白 -膽固醇的測定 .........................................45七、紫外分光光度法檢測核酸的濃度及純度 .............................46第 4章 將混合物中各種組分分開——層析技術 .................................... 48第 1節 層析技術概述 ............................ 48一、層析技術的形成和發展 .............48二、層析技術的基本原理 .................49三、層析技術的分類 .........................49四、層析技術的基本要求 .................50第 2節 吸附層析 .................................... 50一、吸附層析的原理 .........................50二、吸附層析的操作 .........................50第 3節 分配層析 .................................... 52一、紙層析的原理 .............................52二、紙層析的操作 .............................52第 4節 凝膠過濾層析 ............................ 54一、凝膠過濾層析的原理 .................54二、凝膠過濾層析的特征常數 .........54三、凝膠過濾層析的常用介質 .........55四、凝膠過濾層析的操作 .................56五、凝膠過濾層析的應用 .................57第 5節 離子交換層析 ............................ 57一、離子交換層析的原理 .................57二、離子交換劑 .................................58三、離子交換層析的操作 .................59四、離子交換層析的應用 .................61第 6節 親和層析 .................................... 61一、親和層析的原理 .........................61二、親和層析的操作 .........................62第 7節 實驗練習 .................................... 63一、氨基酸的分離鑒定——紙層析法 .............................................63二、轉氨酶的活性鑒定——薄層層析法 .............................................64三、核苷酸的分離——離子交換柱層析法 .........................................65四、胰蛋白酶的分離純化——親和層析法 .........................................67五、血清蛋白質的層析分離——分子篩層析法 .............................68第 5章 分離帶電顆粒的有效手段——電泳技術 .................................... 69第 1節 電泳技術概述 ............................ 69一、電泳技術的形成和發展 .............69二、電泳技術的基本原理 .................70第 2節 影響電泳的因素 ........................ 71一、溶液的 pH...................................71二、緩沖液的離子強度 .....................71三、電場強度 .....................................72四、電滲作用 .....................................72第 3節 常用電泳技術 ............................ 72一、紙電泳和醋酸纖維素薄膜電泳 .............................................72二、凝膠電泳 .....................................73三、等電聚焦電泳 .............................75四、雙向電泳 .....................................76五、核酸電泳 .....................................77六、印跡轉移電泳 .............................79第 4節 實驗練習 .................................... 79一、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 .............................................79二、血清乳酸脫氫酶同工酶瓊脂糖凝膠電泳 .................................81三、血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳...........................................82四、 SDS-聚酰胺凝膠電泳測定蛋白質的相對分子質量 .........83五、 DNA瓊脂糖凝膠電泳 ...............86六、限制性內切酶對質粒 DNA酶切產物的電泳鑒定 .................87 VII …………目 錄第 6章 利用離心場沉降大分子——離心技術 .................................... 90第 1節離心技術的基本原理 ................ 90一、顆粒沉降的原理 .........................90二、沉降系數 .....................................91三、相對離心力 .................................91第 2節 離心機的類型及操作規程 ........ 91一、離心機的類型 .............................91二、制備型離心機 .............................92三、分析型離心機 .............................94四、離心操作的注意事項 .................94第 3節 制備型超速離心的分離方法 .... 95一、差速沉降離心法 .........................95二、密度梯度區帶離心法 .................95三、等密度梯度區帶離心法 .............96第 4節 實驗練習 .................................... 96一、肝糖原的提取和鑒定 .................96二、酪蛋白的制備 .............................97三、動物 DNA的提取 ..............98四、酵母 RNA的提取及成分鑒定 ...........................................100五、質粒 DNA的提取與鑒定 ........101六、感受態細菌的制備及質粒DNA的轉化.............................104七、蔗糖密度梯度離心分離病毒 ...........................................106第 7章 利用堿基互補探查核酸序列——分子雜交技術 ............ 109第 1節 核酸分子雜交的基本原理 ...... 109一、變性與復性 ...............................109二、建立在 DNA變性與復性基礎上的核酸雜交技術 ...................110第 2節 核酸分子雜交的主要類型及程序 ...........................................111一、固相雜交的支持物...................111二、常用的轉移方法 .......................112三、固相雜交的基本程序...............112四、固相雜交的主要類型 ...............113第 3節 核酸探針的分類和標記 .......... 114一、核酸探針的分類 .......................114二、核酸探針的標記 .......................115第 4節 實驗練習 .................................. 117一、 Southern雜交 ...........................117二、 Northern雜交 ...........................118三、組織原位雜交 ...........................120四、斑點雜交 ...................................121第 8章 微量 DNA的體外擴增——PCR技術................................. 123第 1節 PCR技術概述 ......................... 123一、基本原理 ...................................123二、主要步驟 ...................................123三、主要特點 ...................................124第 2節 PCR的反應體系及操作 ......... 125一、 PCR反應體系 ..........................125二、 PCR的操作及注意事項 ..........125三、 PCR反應條件的優化 ..............127四、 PCR產物的檢測分析 ..............128第 3節 PCR的衍生技術 ..................... 128一、逆轉錄 -PCR.............................128二、實時熒光定量 PCR ..................129三、特殊 PCR ..................................130第 4節 PCR技術的應用 ..................... 132一、分子生物學領域 .......................132二、臨床醫學領域 ...........................133三、其他領域 ...................................134第 5節 實驗練習 .................................. 134逆轉錄 PCR ......................................134第 9章 閱讀遺傳天書的步——測序技術 .................................. 137第 1節 DNA測序的基本原理............ 137第 2節 DNA測序的常用方法 ............ 138一、酶學法——雙脫氧鏈終止法 .......................................138二、化學（裂解）法——Maxam-Gilbert測序法 ..........................140 三、酶學法與化學法的比較 ...........141第 3節 DNA測序自動化 .................... 143第 4節實驗練習.................................. 144雙脫氧鏈終止法測定 DNA序列 ....144轉基因技術 ........................... 147第 1節轉基因技術概述 ...................... 147一、轉基因動物技術的原理 ...........147二、轉基因動物技術的成果 ...........148第 2節建立轉基因動物的方法 .......... 149一、目的基因的制備 .......................149二、轉基因動物的制備方法 ...........149三、轉基因小鼠 ...............................156第 3節轉基因動物的應用 .................. 156一、研究基因的結構和功能及其表達與調控 ...............................156二、建立人類疾病動物模型...........157三、研究人類疾病基因治療 ...........157四、利用轉基因動物生產生物活性蛋白 ...................................157五、利用轉基因動物生產人用器官移植的供體 .......................158六、利用轉基因技術改良動物品種和生產性能.......................158第 4節轉基因的安全性問題 .............. 159一、轉基因生物的安全性 ...............159二、轉基因食品的安全性 ...............159第 5節實驗練習 .................................. 160一、轉基因動物技術中外源基因的制備 .......................................160二、顯微注射...................................161第 11章 置換生物體的某種基因——基因打靶技術 ....................... 165第 1節基因敲除技術概述.................. 165一、基因敲除技術的建立和發展 ...........................................165二、基因敲除的基本原理...............167第 2節基因敲除的方法及進展 .......... 170一、條件性基因敲除法 ...................170二、誘導性基因敲除法 ...................171三、利用插入突變進行基因敲除 ...........................................171第 3節基因敲除小鼠的制備過程 ...... 174一、目標載體的構建 .......................174二、 ES細胞培養 .............................174三、 ES細胞的轉化 .........................175四、挑克隆 .......................................175五、抗性 ES細胞克隆的凍存 ........175六、 ES細胞基因組 DNA的提取 ...........................................175七、克隆的分析和鑒定 ...................175八、染色體分析 ...............................176九、嵌合體小鼠的制備 ...................176十、品系的建立 ...............................176第 4節基因敲除技術的應用及缺陷 ... 177一、基因敲除技術的應用 ...............177二、基因敲除技術的缺陷 ...............178第 12章 21世紀的生命科學技術——蛋白質組學技術 ................... 180第 1節 蛋白質組學概論 ...................... 180一、蛋白質組學 ...............................180二、蛋白質組學研究的策略和范圍 ...........................................182三、蛋白質組學發展趨勢 ...............182第 2節 蛋白質組學技術 ...................... 183一、樣品制備 ...................................183二、樣品分離技術 ...........................184三、樣品鑒定技術 ...........................190第 3節 蛋白質組生物信息學 .............. 195第 4節 實驗練習 .................................. 196一、家兔血清蛋白質組二維凝膠電泳技術的建立 .......................196二、正常人尿蛋白質組學研究 .......198第 13章 蛋白質與核酸相互作用分析——EMSA和 ChIP技術 .....200第 1節 電泳遷移阻滯實驗（EMSA）... 200 目 錄IX …………一、電泳遷移阻滯實驗（ EMSA）的基本原理 ...............................200二、電泳遷移阻滯實驗（ EMSA）的基本操作步驟.......................200第 2節 染色質免疫沉淀（ ChIP）技術 .......................................... 202一、染色質免疫沉淀（ChIP）技術的基本原理 ...............................202二、染色質免疫沉淀（ ChIP）技術的基本操作步驟.......................202第 3節 實驗練習 .................................. 204一、經 EMSA驗證姜黃素可減少 B淋巴細胞核中 NF-κB的量 .....204二、經 ChIP驗證姜黃素可減少 B淋巴細胞核中 NF-κB的量 .....207第 14章 蛋白質和蛋白質相互作用分析——酵母雙雜交等技術 ....211第 1節 概述 .......................................... 211一、蛋白質相互作用的分子結構基礎 ...........................................211二、蛋白質相互作用分析的意義 ...212三、相互作用蛋白質組學的研究技術平臺 ...................................213第 2節 酵母雙雜交技術 ...................... 215一、酵母雙雜交系統的原理...........215二、酵母雙雜交系統的應用 ...........216三、酵母細胞內的高通量酵母雙雜交 .......................................216四、酵母雙雜交系統的幾個版本 ...216五、酵母雙雜交系統的假陽性問題 ...........................................217第 3節 其他常用技術 .......................... 217一、細菌雙雜交技術.......................217二、噬菌體展示技術 .......................218三、依賴親和力篩選相互作用蛋白質的技術 ...........................219四、蛋白質芯片技術 .......................221第 4節 實驗練習 .................................. 222一、酵母雙雜交技術篩選 TRAC-1相互作用蛋白 ...........................222二、 GST融合蛋白沉降技術篩選RNF114相互作用蛋白 ............226第 15章 科學發展的不竭源泉——技術創新 .................................... 230第 1節 “三性”實驗 ............................ 230一、“三性”實驗的概念.................230二、“三性”實驗的特點和意義 .....230三、實驗教學體系的改革 ...............231四、“三性”實驗的基本要求 .........232五、“三性”實驗的一般程序 .........232六、“三性”實驗的選題原則 .........232七、“三性”實驗的實施及評估 .....233第 2節 實驗練習 .................................. 233一、酵母蔗糖酶的純化及性質研究 ...........................................233二、豬胰蛋白酶的純化及其活性測定 ...........................................238三、 DNA重組實驗.........................241實驗室管理 ...................................249第 1節實驗室規則 .............................. 249第 2節實驗用品的清洗 ...................... 250一、玻璃儀器的清洗 .......................250二、塑料器皿的清洗 .......................251三、實驗器皿的干燥與消毒 ...........251四、常用洗滌液及其配制 ...............251第 3節實驗標本的制備 ...................... 252一、血液樣品的制備與保存 ...........252二、尿液標本的收集與保存 ...........253三、組織樣品的制備與保存 ...........253第 4節實驗儀器的使用 ...................... 254一、刻度吸管的使用 .......................254二、微量進樣器的使用 ...................255三、單道可調式移液器的使用 .......256四、蒸汽壓力滅菌器的使用 ...........256 五、酸度計的使用 ...........................256六、干燥箱和恒溫箱的使用 ...........258七、電熱恒溫水浴鍋的使用 ...........259第 5節實驗數據的處理 ...................... 259一、列表法 .......................................259二、作圖法 .......................................260三、少量實驗數據的處理 ...............261四、實驗誤差和提高實驗準確度的方法 .......................................261第 6節實驗報告的書寫 ...................... 263一、實驗記錄 ...................................263一、一般化學試劑的分級及配制的注意事項 ...............................264二、實驗室中常用酸堿的密度和濃度...........................................266三、常用緩沖溶液及配制方法.......266四、溴化乙錠溶液的凈化處理 .......271五、離心機轉數與相對離心力的換算 ...........................................272六、銨飽和度的常用表...........273七、元素相對原子質量表 ...............275二、實驗報告 ...................................263參考文獻...................................................277 第 7節常用實驗數據 .......................... 264