工程細胞生物學（簡體書）

工程細胞生物學是細胞生物學的重要分支學科，是細胞生物學和細胞工程學的新興交叉邊緣學科。它以細胞生物學的理論和技術體系為基礎，以細胞工程學中工程細胞為對象，在分子、細胞等不同層面上，揭示工程細胞的各種生命活動規律，以期按照人們的意圖對工程細胞的遺傳物質、細胞組分及遺傳表型進行重組改造，從而獲得有重要應用價值的新型工程細胞表達產物（產品）。可以說，工程細胞生物學是細胞生物學的應用和拓展，同時又為細胞工程學的發展提供重要的理論和技術支撐。因此，工程細胞生物學不僅涉及細胞生物學的基本內容，如生長分化、增殖調控、運輸分泌、信號轉導和衰老凋亡等基本生命現象，又涵蓋細胞工程相關內容，如工程細胞改造及篩選、高密度培養條件、培養體系微環境中的代謝變化等。《普通高等教育“十一五”國家級規劃教材：工程細胞生物學》著重介紹工程細胞生物學基本概念、主要內容、研究方法和技術以及應用現狀，並拓展介紹了部分重點實驗操作和工程知識。書中設計了部分知識拓展框，以豐富學科進展方面的內容。《普通高等教育“十一五”國家級規劃教材：工程細胞生物學》可作為生命科學、基礎醫學相關專業本科生、研究生教材，也可供其他相關領域工作人員參考使用。

陳志南主編的《工程細胞生物學》在內容上分為三個部分，第一部分從總體上介紹工程細胞研究涉及的各種技術；第二部分著重闡述與工程細胞緊密相關的基礎知識；第三部分系統論述細胞工程的實際操作和應用技術。本書力圖體現的特色是：其一，基礎知識與實際應用緊密結合；其二，基本知識與研究進展有機整合；其三，多學科、多層面的系統融合。因此可以說，本教材既體現了生命科學迅猛發展的現實要求，又顯示出編寫者在理論和技術體系創新上的積極探索。教學過程中，可依據教學對象和學時要求選擇相關內容。同時，本書詳細的技術規程、操作程序及莢鍵環節參數控制等內容，也可作為相關研究人員手邊的工作指南。書中部分研究成果也反映了編者所在單位，在基礎和應用研究以及“863”計劃等國家課題支持下，在細胞大規模培養技術體系建立方面的研究工作進展。

前言第一章緒論1．1工程細胞生物學的基本概念1．2工程細胞學與細胞生物學的聯繫和發展1．3工程細胞生物學研究及應用現狀第二章工程細胞生物學的研究方法和技術2．1細胞形態學觀察技術2．2免疫細胞化學技術2．3細胞的分離與培養技術2．4工程細胞的構建技術2．5細胞的三維培養技術2．6工程細胞無血清懸浮培養技術第三章工程細胞生物學基礎3．1細胞的基本概念3．2細胞核與遺傳信息傳遞3．3核糖體與蛋白質的生物合成3．4細胞物質的代謝3．5細胞內膜系統與蛋白質合成分泌3．6細胞膜與細胞間或細胞基質間相互作用3．7線粒體與能量代謝3．8細胞骨架與細胞遷徙、伸展和運動3．9蛋白酶體與細胞內蛋白質降解3．10細胞週期及其調控3．11細胞分化與基因表達調控3．12細胞衰老與凋亡第四章工程細胞生物學4．1工程細胞的概念和分類4．2動物工程細胞基礎4．3植物工程細胞基礎4．4工程細胞的構建及改良4．5高效表達載體構建4．6工程細胞庫與質量控制4．7工程細胞的增殖及代謝特徵4．8工程細胞高密度培養工藝與目標產品4．9工程細胞表達產品的分離純化4．10工程細胞表達產品的質量控制4．11幹細胞工程4．12基於工程細胞的研究及應用4．13工程細胞工業化放大及應用附錄一漢英名詞對照附錄二英漢名詞對照

第一章緒論
1.1工程細胞生物學的基本概念
工程細胞生物學是細胞生物學的重要分支學科，是細胞生物學和細胞工程學的新興交叉邊緣學科。工程細胞生物學的研究內容不僅涉及細胞生物學的基本內容，如細胞的生長分化、增殖調控、運輸分泌、信號轉導和衰老凋亡等基本生命現象；同時又涵蓋細胞工程相關內容，如工程細胞的改造及篩選、高密度培養條件及優化、培養體系微環境中的代謝變化及調節等。
1.1.1細胞工程和工程細胞的基本概念和分類
1.1.1.1細胞工程的概念和研究范疇
細胞是包含了全部生命信息和體現生命所有基本特點的獨立生命單位，對細胞結構和活動的研究是一切生命科學的重要基礎。20世紀70年代末至80年代初，隨著細胞生物學和分子生物學突飛猛進的發展，人類已經可以在探索細胞生命活動規律的基礎上，在細胞和基因的水平上干預和改造生物的遺傳性狀，從而依照人類的意愿，設計出新的生物基因藍圖，然后據此制造出新的生命體。正如德國著名哲學家尤根?米特斯特拉斯所指出的：“我們的科學知識正在把我們逐漸推到一種不僅能夠知道我們的（生物）本質，而且還能加以改變的位置上。”細胞工程就是這樣一門新型學科。
細胞工程，是指應用現代細胞生物學、分子生物學、遺傳和發育生物學等理論與方法，通過類似工程學的步驟，在細胞整體水平和細胞器水平上進行遺傳操作，重組細胞的結構和內含物，按照人們的意愿改變生物的結構和功能，即通過細胞融合、核質移植、染色體或基因移植以及組織、細胞培養等方法，快速繁殖和培養出人們所需要的新物種、新產品的生物工程技術。通俗地講，細胞工程是在細胞水平上做手術，也稱細胞操作技術。例如，細胞融合技術避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作，只需將細胞遺傳物質直接轉移到受體細胞中，就能形成雜交細胞，因而能提高基因轉移效率。
目前細胞工程的主要研究領域包括：①動、植物細胞和組織培養；②細胞融合育種與單克隆抗體；③細胞核移植與克隆；④染色體工程育種；⑤發育基因調控與人體器官培養技術等。細胞工程涉及的技術領域是對細胞不同結構層次的改造，包括細胞整體層次，如細胞培養、細胞融合等；細胞器層次，如核移植、細胞拆合、染色體倍性或組成改變等；分子層次，如基因操作技術等。隨著基因工程技術、基因轉移技術和干細胞工程技術的發展，細胞工程在理論和應用兩方面獲得了快速發展。
根據細胞類型的不同，細胞工程具體分為動物細胞工程、植物細胞工程和微生物細胞工程。首先，動物細胞與植物細胞相比，在遺傳和生理特性等方面都有很大的不同：①動物細胞沒有葉綠體和細胞壁，其物質與能量代謝途徑與植物細胞不同；②高等動物的細胞在動物體內生長時，既相互依賴又相互制約，在神經及體液調節下形成了一種非常復雜的內環境，動物細胞在體內受整體調節制約的程度和復雜度，都是植物細胞不能相比的；③動物細胞分化的程度和類別也比植物細胞更高、更復雜，脫分化非常困難；④與植物細胞不同，動物細胞除卵細胞外，都只有遺傳上的全能性而沒有細胞上的全能性；⑤在體外培養時，除癌細胞和血細胞外，正常的動物細胞都有貼附于支持物生長的特性，并且發生接觸抑制，而停止分裂和增殖；⑥所有高等動物細胞都是有壽限的，細胞分裂最多不能超過50代次分化，而植物細胞沒有壽限。隨著細胞生物學、分子生物學和細胞遺傳學研究的日益深入及相關技術的長足發展，動物細胞工程得到了迅速發展，并且在醫學研究和實踐應用中應用日益廣泛。當今，動物細胞工程對提高人類的生活質量和健康水平，發揮著越來越重要的作用。
微生物作為可以獨立存在的個體，其生長代謝的特點與植物、動物有著顯著的區別，可由其自身完成其基本功能。微生物細胞工程以微生物細胞為研究對象，利用微生物發酵作用，通過現代工程技術手段來生產有用物質，或者把微生物直接應用于生物反應器技術。此外，對微生物細胞的改造也屬于微生物細胞工程的研究內容，在遺傳育種、微生物發酵、環境保護和農藥生產工業上具有重要意義。其應用從人們日常飲用的酒、乳酸、調味的醋、醬油，到抗生素、激素、疫苗等，無一不是微生物發酵的產物；在農業和環境保護方面，用于土壤改良，減少土壤里的殘毒，增加土壤肥力和制造對人無毒副作用的微生物農藥、微生物肥料和微生物飼料；在農藥生產方面，利用細菌、病毒、真菌等病原微生物防治作物的病蟲害本身就是一種無污染的新興生物農藥。
1.1.1.2細胞工程的主要研究內容
細胞工程依遺傳操作的不同，可分為細胞融合工程、基因工程、細胞拆合工程、染色體及染色體組工程；依培養技術的不同，可分為大規模細胞培養技術和干細胞工程。
1）細胞融合工程
細胞融合（cellfusion）又稱細胞雜交（cellhybridization）。它是指在自然條件下或用人工方法（生物的、物理的、化學的），使兩種或兩種以上的體細胞合并形成一個細胞，這是一種不經過有性生殖過程而得到雜種細胞的方法。在多細胞生物中，它是一種基本的發育與生理活動。
自發的動物細胞融合概率很低，1962年日本學者岡田善雄發現滅活的仙臺病毒可誘導小鼠艾氏腹水癌細胞彼此融合。20世紀60年代后期，研究人員發明了只讓雜種細胞存活并傳代的技術，該技術使未發生融合的親本細胞及非兩親本融合的細胞在傳代過程中被淘汰。1975年，Milstein和Kohler將小鼠骨髓瘤細胞與羊紅細胞免疫過的小鼠淋巴細胞融合，形成雜種細胞，能分泌抗羊紅細胞抗體，用于制備單克隆抗體。細胞融合可實現任意細胞間的融合而不受親緣關系的限制，這就拓寬了遺傳變異的范圍。細胞融合技術具有巨大的應用潛力，如醫學上的單克隆抗體的生產和植物界新物種的培育等。盡管細胞融合的重要性如此之大，但細胞的融合過程是如何在基因控制下發生和發展的，人們一直沒有搞清楚。
2）基因工程
基因工程即重組DNA技術，是從基因水平改造生物遺傳組成，進而改變細胞的表型，所以將其納入細胞工程的范疇。它是一種按照人類的意愿，定向改變生物遺傳性狀的技術工程，即采用類似工程設計的方法，按照預先設計將不同來源的目的基因在體外切割、拼接和重新組合，形成重組基因，然后通過運載體導入宿主細胞，使其在宿主細胞內復制和表達以獲得新生物產品、改變生物原有的遺傳特性或創造出具有新遺傳性狀的生物新品種。
3）染色體工程和染色體組工程
染色體工程是按照預先的設計，添加、消除或替代同種或異種染色體的全部或一部分，從而達到定向改變生物遺傳性狀或選育新品種的目的。它是從染色體水平改變細胞遺傳組成的細胞工程技術，主要分為動物染色體工程和植物染色體工程兩種。動物染色體工程主要采用對細胞進行顯微操作的方法來達到轉移基因的目的；而植物染色體工程目前主要是利用傳統的雜交、回交等方法來達到改變染色體的目的。染色體工程目前主要應用于植物遺傳育種領域。
染色體組工程是在人為設計的技術路線下添加、消除同種或異種染色體組以達到定向改變生物遺傳性狀的目的。
4）細胞拆合工程
細胞拆合工程又稱細胞質工程，研究真核細胞的核、質相互關系，以及細胞器，細胞胞質基因的轉移等細胞拆合的技術。該技術主要研究內容是進行細胞組分的分離和融合，研究細胞質和細胞器的添加和替代。具體操作方法是通過物理或化學方法將細胞質與細胞核分開，再進行不同細胞間核質的重新組合，重建成新細胞。常用的技術就是細胞核移植、胞質體（去核細胞）與完整細胞的融合、細胞器導入完整細胞及大分子直接導入細胞等。其目的是創造出細胞質與細胞核的雜種細胞，這種雜種細胞便有可能出現遺傳的變異，出現胞質遺傳與胞核遺傳的重新組合。細胞拆合最成功的例子是克隆羊“多莉”的誕生。它是通過無性繁殖制備與母體在遺傳上一致的克隆動物，即將其母體體細胞的核與去核卵子的細胞質人工重組，借助于卵子的發育能力，制造成的高等動物克隆。
5）干細胞工程
干細胞工程是在細胞培養技術的基礎上發展起來的一項新的細胞工程。它是利用干細胞的增殖特性、多分化潛能及其增殖分化的高度有序性，通過體外培養干細胞、誘導干細胞定向分化或利用轉基因技術處理干細胞改變其特性的方法，以達到利用干細胞為人類服務的目的。
其主要研究內容，一方面，胚胎干細胞的研究，如建立胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）系，并利用ES細胞的發育多能性即環境因素對細胞分化發育的影響，定向誘導細胞分化為特定的細胞，如肌細胞、神經細胞等，作為細胞移植的新來源。另一方面，成體干細胞的研究主要包括：成體組織干細胞的分離培養和植入體內，更新機體病變的組織器官恢復正常功能；成體組織干細胞作為基因治療的靶細胞；研究體內有效激活成體組織干細胞的方法，增強其功能。
6）大規模細胞培養技術
大規模細胞培養技術是細胞工程中重要的組成部分，是在人工條件下高密度大規模培養動、植物細胞，用來生產生物技術產品的技術。如今這一技術已廣泛應用于現代生物制藥的研究和生產中。它的應用大大減少了用于疾病預防、治療和診斷的實驗動物，為生產疫苗、細胞因子、生物產品乃至人造組織等產品提供了強有力的工具。
根據細胞的生長特性，可分為貼壁細胞和懸浮細胞。就其培養方法而言可概括為懸浮培養和固定化培養。就操作方式而言，可分為分批式、補料?分批或流加式、半連續式、連續灌流式4種操作方式。大規模培養技術的建立，使各種生物制品，如單抗、紅細胞生成素、疫苗和病毒殺蟲劑等的生產得到了很大的發展。
1.1.1.3工程細胞的概念和分類
經典意義上，工程細胞即基因工程細胞，是經過改造并被轉入了基因的細胞。具體地講，是指采用基因工程技術或細胞融合技術對宿主細胞的遺傳物質進行修飾改造或重組，獲得具有穩定遺傳的獨特性狀的細胞系。通過改造的工程細胞獲得或提高了重組蛋白類藥物表達的產量和質量。從細胞工程這個大的概念上講，凡是由細胞工程技術包括細胞融合工程、基因工程、細胞拆合工程和染色體工程構建的細胞，或用于細胞工程培養技術如干細胞工程、大規模培養技術的細胞均屬于工程細胞的概念范疇。在本書中，工程細胞主要指后者，即用于大規模培養技術制備生物技術藥物的動物細胞。
工程細胞依據組織器官來源包括原核細胞、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和干細胞等；依據構建方法和應用分為基因工程細胞、組織工程細胞等；依據生長方式可分為貼壁細胞和懸浮細胞；依據生存期分為有限細胞系和永生化細胞系。
盡管近年來工程細胞的構建取得了重大進展，但目前工程細胞的構建都沿襲經驗的方法。例如，在工業生物制藥領域普遍采用的工程細胞系構建策略仍然需要費時費力的克隆篩選，常常耗時幾個月。更為主要的是，沒有可靠的預測或模擬克隆株在大規模生物反應器條件下細胞生長特性和產物分泌能力的辦法，致使篩選的克隆株在大規模生產條件下難以再現小規模實驗條件下相同的細胞生長和產物分泌能力。因而，這些策略都存在很大程度的可變性和不穩定性。究其根本原因在于，缺乏對哺乳動物細胞培養過程變化最本質的理解，缺乏對細胞遺傳學機制的理解，缺乏對工程細胞的生物學和生理學行為的理解，特別是缺乏對如何獲得能夠分泌高產率、高質量蛋白質的工程細胞的細胞與分子生物學機制的理解。
分泌抗體或重組蛋白的工程細胞不同于自然來源的體內細胞，含有有意識的人為的改造，因而其表型及其應用均具有定向性和目的性。另外，工程細胞的獲得也是有一定的選擇性的。其篩選條件是多種多樣的，除了細胞本身的改造以適應細胞的高密度、高產率培養外，還包括培養條件、培養規模、生產和市場需求等。因此隨著細胞工程的不斷發展，工程細胞的基礎和應用研究也不斷擴展和深入。因而，對工程細胞生物學行為研究的需求也日益迫切。
1.1.2工程細胞生物學的概念、內涵和研究范疇
1.1.2.1工程細胞生物學的概念和內涵
工程細胞生物學以細胞生物學的理論和技術體系為基礎，以細胞工程學中的工程細胞為對象，在分子、細胞等不同層面上，揭示工程細胞的各種生命活動規律，以期按照人們的意圖對工程細胞的遺傳物質、細胞組分及遺傳表型進行重組改造，從而獲得有重要應用價值的新型工程細胞表達產物（產品）。可以說，工程細胞生物學是細胞生物學的應用和拓展，同時又為細胞工程學的發展提供重要的理論和技術支撐。目前，工程細胞生物學這一領域所涉及的研究內容已成為國外細胞工程及生物制藥尤其是抗體制藥領域的重要發展方向和趨勢。
1.1.2.2工程細胞生物學研究范疇
工程細胞生物學主要對于工程細胞在體外長期培養條件下的生物學行為的適應與調控機制進行研究。
（1）研究工程細胞在體外規模化培養條件下的細胞生長代謝等分子細胞生物學行為的改變及其調節機制，包括：工程細胞的永生化，工程細胞的葡萄糖轉運及代謝、脂代謝及其調節，細胞的氨基酸代謝調節與細胞生長凋亡的關系，無血清培養條件下的細胞體積變大、液泡出現等適應性改變、細胞抵抗“失巢”而黏附聚集成團，以及細胞高密度生長代謝的營養需求等規模化培養中的關鍵問題。闡明這些現象本質與分子機制，為工程細胞的規模化培養提供全面性、系統性、新穎性和可操作性的理論指導。
（2）研究工程細胞在體外規模化培養條件下的蛋白質合成分泌生物學行為的改變及其調控機制。體外培養條件下的工程細胞其重組蛋白、抗體等合成分泌的生物學行為不同于自然來源的體內B淋巴細胞等，有其特殊性，如體外長期培養和高產率分泌常常導致產物發生質與量的改變，尤其是在進行生物反應器培養時，各種理化參數，如攪拌通氣、工藝放大，以及不同培養批次間細胞培養環境及生物反應器操作條件的改變可對抗體的分泌量、分泌抗體的質量均產生重要的影響。闡明這些現象本質與分子機制，為提高工程細胞抗體分泌量及產率提供重要的理論指導。
1.2工程細胞學與細胞生物學的聯系和發展
由于工程細胞生物學是細胞生物學的重要分支學科，是細胞生物學和細胞工程學的新興交叉邊緣學科，因而，細胞生物學和細胞工程學的歷史發展即生動展現了工程細胞生物學的歷史發展。在其各自的歷史發展中，二者交互影響，相互推動，最終形成了一門新興學科――工程細胞生物學。
1.2.1細胞生物學的歷史發展
從研究內容來看細胞生物學的發展可分為3個層次，即顯微水平、超微水平和分子水平。從時間縱軸來看細胞生物學的歷史大致可以劃分為4個主要的階段。
第一階段：細胞的發現及細胞學說的創立。從16世紀后期到19世紀30年代，是細胞發現和細胞知識的積累階段。通過對大量動、植物的觀察，人們逐漸意識到不同的生物都是由形形色色的細胞構成的。
第二階段：實驗細胞學（experimentalcytology）時期。從19世紀30年代到20世紀初期，細胞學說形成后，開辟了一個新的研究領域，在顯微水平研究細胞的結構與功能是這一時期的主要特點。形態學、胚胎學和染色體知識的積累，使人們認識了細胞在生命活動中的重要作用。細胞學的發展主要是采用實驗的手段研究細胞學的問題，其特點是從形態結構的觀察深入到生理功能、生物化學、遺傳發育機理的研究。由于實驗研究不斷同相鄰學科結合、相互滲透，導致了一些重要分支學科的建立和發展：細胞遺傳學（cytogenetics）、細胞生理學（cytophysiology）、細胞化學（cytochemistry）。1893年Hertwig的專著《細胞與組織》（DieZelleunddieGewebe）出版，標志著細胞學的誕生。其后1896年哥倫比亞大學Wilson編著的《發育與遺傳學中的細胞》（TheCellinDevelopmentandHeredity）、1920年墨爾本大學Agar編著的《細胞學》（Cytology）都是這一領域最早的教科書。
第三階段：細胞生物學的誕生。20世紀30～70年代，電子顯微鏡技術出現后，把細胞學帶入了第三個發展時期，這短短40年間不僅發現了細胞的各類超微結構，而且也認識了細胞膜、線粒體、葉綠體等不同結構的功能，使細胞學發展為細胞生物學。Robertis等1924年出版的《普通細胞學》（GeneralCytology）在1965年第四版的時候定名為《細胞生物學》（CellBiology），這是最早的細胞生物學教材之一。
第四階段：分子細胞生物學時期。從20世紀70年代基因重組技術的出現到當前，細胞生物學與分子生物學的結合越來越緊密，研究細胞的分子結構及其在生命活動中的作用成為主要任務，基因調控、信號轉導、腫瘤生物學、細胞分化和凋亡是當代分子細胞生物學的研究熱點。
1.2.1.1顯微鏡的發明與細胞的發現沒有顯微鏡就不可能有細胞學誕生。
（1）1590年，荷蘭眼鏡制造商J.Janssen和Z.Janssen父子制作了第一臺復式顯微鏡。
（2）1665年，英國人Hook首次描述了植物細胞（木栓），命名cella。
（3）1680年，荷蘭人Leeuwenhoek當選為英國皇家學會會員，他一生中制作了200多臺顯微鏡和400多個鏡頭，用設計較好的顯微鏡觀察了許多動植物的活細胞與原生動物。
（4）1752年，英國人Dollond發明消色差顯微鏡。
（5）1812年，蘇格蘭人Brewster發明油浸物鏡，改進了體視顯微鏡。
（6）1886年，德國人Abbe發明復消差顯微鏡，并改進了油浸物鏡，至此普通光學顯微鏡技術基本成熟。
（7）1932年，荷蘭籍德國人Zernike成功設計了相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope），并因此獲1953年度諾貝爾物理學獎。
（8）1932年，德國人Knoll和Ruska發明電子顯微鏡，1940年，美國、德國制造出分辨力為0.2nm的商品電子顯微鏡。
（9）1981年，瑞士人Binnig和Rohrer在IBM蘇黎世實驗中心（ZurichResearchCenter）發明了掃描隧道顯微鏡而與電子顯微鏡發明者Ruska同獲1986年度的諾貝爾物理學獎。
1.2.1.2細胞學說
（1）1809年，法國人Lamark提出：“一切生物體都是由細胞構成的。只有具有細胞的機體，才有生命。”
（2）1802年，法國植物學家BrisseauMilbel指出：“植物的每一部分都有細胞存在。”
（3）1824年，法國生理學家Dutrochet進一步描述了細胞的原理。
（4）1838年，德國植物學教授Schleiden發表“植物發生論”，認為無論怎樣復雜的植物都由形形色色的細胞構成。
（5）1838年，德國解剖學教授Schwann通過研究Schleiden的細胞形成學說，提出了“細胞學說”（celltheory）這個術語；并于1939年發表了“關于動植物結構和生長一致性的顯微研究”。Schwann提出：有機體是由細胞構成的；細胞是構成有機體的基本單位。
（6）1855年，德國人Virchow提出“一切細胞來源于細胞”的著名論斷，進一步完善了細胞學說。把細胞作為生命的一般單位，以及作為動、植物界生命現象的共同基礎的這種概念立即得到了普遍的接受。