農業生物技術（簡體書）

生物技術是20世紀末人類科技史上最令人矚目的高新技術之一，它為提高國力，以及解決人類面臨的食品短缺、疾病防治、人口膨脹、環境污染、能源匱乏等一系列重大問題帶來了希望。國際上，科學家和企業家公認，信息技術和生物技術是21世紀關系到國家命運的關鍵技術及創新產業經濟發展的增長點。
《農業生物技術》(作者夏海武、曹慧)在介紹農業生物技術的概念、研究內容及主要特點的基礎上，主要闡述植物遺傳育種的原理與技術、分子標記輔助育種、植物細胞工程、植物基因工程、微生物發酵工程等內容。

前言
第一章 緒論
第一節 農業生物技術的含義
第二節 農業生物技術的發展簡史
一、植物遺傳育種技術的發展
二、植物組織培養及細胞工程技術的發展
三、植物基因工程與分子標記技術的發展
四、發酵工程的發展
第三節 農業生物技術的特點
一、重大理論和技術突破,推動農業生物技術發展
二、農業生物技術呈現明顯的高新技術特征
三、農業生物技術是以基因工程為核心的綜合技術

第二章 植物遺傳育種
第一節 選擇育種
一、選擇與選擇育種
二、有性繁殖植物的選擇育種
三、無性繁殖植物的選擇育種
第二節 有性雜交育種
一、有性雜交育種的概念
二、有性雜交育種的雜交方式
三、雜交親本的選擇與選配
四、有性雜交技術
五、雜種后代的處理
六、遠緣雜交育種
第三節 雜種優勢與利用
一、雜種優勢的遺傳理論
二、雜種優勢的衡量方法
三、優勢育種與有性雜交育種的比較
四、雜種優勢育種的一般程序
五、雄性不育系的選育和利用
六、自交不親和系及其利用
第四節 誘變育種
一、物理誘變育種
二、化學誘變育種
三、多倍體育種

第三章 分子標記輔助育種
第一節 分子標記概述
一、分子標記的發展
二、分子標記的優越性
第二節 分子標記的類型及特點
一、基于分子雜交的分子標記
二、基于PCR技術的分子標記
三、基于基因芯片等的分子標記
第三節 分子標記技術的應用
一、分子遺傳圖譜的構建
二、遺傳多樣性與種質鑒定
三、重要農藝性狀相關基因的定位
四、分子標記輔助選擇
五、重要農藝性狀的圖位克隆

第四章 植物細胞工程
第一節 植物的脫毒與離體快繁
一、植物脫毒的方法
二、脫病毒植株的檢測
三、脫病毒植株的保存與繁殖
四、植物離體快繁技術
第二節 植物體細胞胚胎建成與人工種子
一、植物胚狀體的產生方式
二、影響胚狀體發生和發育的因素
三、人工種子
第三節 性細胞培養與單倍體育種
一、花藥培養
二、花粉(小孢子)培養
第四節 原生質體培養和體細胞雜交
一、植物原生質體培養
二、植物體細胞雜交

第五章 植物基因工程
第一節 植物基因工程的載體和工具酶
一、植物基因工程所需要的載體
二、基因工程所需要的工具酶
第二節 目的基因的分離和克隆
一、基因文庫的構建與目的基因的篩選
二、目的基因的分離
第三節 植物的遺傳轉化
一、植物基因轉化的受體系統
二、農桿菌介導的基因轉移
三、目的基因的直接轉化方法
四、利用植物的種質系統進行外源基因的導入
第四節 轉基因植株的鑒定
一、報告基因的表達檢測
二、外源基因整合的分子雜交檢測
三、轉基因植物的PCR檢測
四、基因芯片檢測
第五節 基因工程在植物遺傳育種上的應用
一、培育抗蟲轉基因植物
二、培育抗病轉基因植物
三、培育抗除草劑轉基因植物
四、培育抗逆境轉基因植物
五、耐儲藏基因的轉化
六、品質改良基因的轉化
七、轉基因植物作為生物反應器

第六章 微生物發酵工程
第一節 菌種的培養技術
一、培養基
二、菌種的制備與擴大培養
第二節 液體發酵
一、發酵設備
二、發酵方式
三、發酵工藝
四、發酵下游處理
第三節 固態發酵
一、固態發酵的設備
二、青貯飼料的固態發酵生產
三、“5406”生物菌肥的固態發酵
四、食用菌的生產
主要參考文獻
附錄

第一章 緒論
第一節 農業生物技術的含義
農業生物技術是指運用基因工程、細胞工程、發酵工程、酶工程及分子育種等生物技術，改良動植物及微生物品種生產性狀、培育動植物及微生物新品種，以及生產生物農藥、獸藥與疫苗的新技術。
農業生物技術是農業現代化的重要組成部分，是21世紀農業科技的先導部分。它不僅是整個生物技術研究及其產業發展的基礎，而且是生物技術中應用最直接、最廣闊及最具現實意義的領域，對解決世界經濟和社會發展面臨的人口、資源、能源、環保等問題，正發揮著日益重要的作用。
農業生物技術以生命科學為基礎，運用基礎學科的科學原理，采用先進的技術手段，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，是為人類生產出所需產品或達到某種目的的技術。先進的技術手段是指基因工程、細胞工程、發酵工程、酶工程等新技術；改造生物體是指獲得品質優良的動物、植物或微生物品種；生物原料是指生物體的某一部分或生物生長過程中產生的能利用的物質，如淀粉、糖蜜、纖維素等有機物質，同時包括一些無機化學品等；為人類生產出的其所需的產品包括糧食、飼料、醫藥、食品、肥料、能源等；達到的某種目的則包括疾病的預防、疾病診斷與治療、食品的檢驗以及環境污染的檢測和治理等。農業生物技術是當前發展最快的技術領域之一，其產業將成為21世紀的支柱產業。
第二節 農業生物技術的發展簡史
一、植物遺傳育種技術的發展
人類栽培植物的歷史已有1萬多年，長期以來人們不斷地尋求提高主要作物產量和質量的方法。傳統的育種過程是一個緩慢而艱辛的過程，但它取得了巨大成功，現今栽培的植物與其野生型的祖先相比，能夠產生更多的生物量、果實和種子。
1900年孟德爾遺傳規律被重新發現以后，用人工雜交培育新品種的方法廣泛應用，并創造出大量動植物的新類型和新品種。例如，1916年，Shull發現玉米的雜種優勢現象，1917年開始用顯性學說以解釋雜種優勢的原因。Hayes和Stakman（1921）、Nishiyama（1929）及McFadden（1930）在燕麥、小麥等植物上的遠緣雜交研究，最終使得野生種的抗病基因轉入栽培種，同時也育成了能抗小麥稈銹病的品種。1927年，Stadler用包括X線在內的多種具有離子化學反應的放射線、紫外線、化學藥劑等成功地誘導玉米突變。1934年，Dustin發現秋水仙素對細胞分裂起作用，1937年，Blakeslee和Avery及Nebel與Ruttle應用秋水仙素加倍染色體數目的技術，奠定了多倍體育種方向。1933年，Rhodes最先發現玉米細胞質雄性不育性，為以后許多植物利用雄性不育特性獲得雜種優勢打下理論基礎和提供準備條件。1949年，Chase發現可用單倍體方法獲得玉米的純合二倍體。1946年，Auerbach和Robson證實可用化學藥品引起遺傳突變。1956年，Sears以核輻射處理的方法將小傘山羊草中的抗葉銹病基因移入普通小麥。
現代育種技術綜合運用分子遺傳學與細胞生物學理論，采用生物物理與化學方法、細胞與基因工程技術，對植物品種種性進行改造，并育成新品種或物種，其包括核輻射誘變育種、激光誘變育種、航天誘變育種、離子束誘變育種、大（小）孢子培養、花粉（藥）培養、體細胞雜交、胚培養育種、無融合生殖育種、無性系變異育種、分子標記輔助育種、轉基因育種等新技術。隨著現代農業的不斷發展及各類學科對植物育種學的滲透和促進，將有更多的新品種不斷被發現和培育，并獲得輝煌的新成就。
二、植物組織培養及細胞工程技術的發展
在Schleiden 和Schwann創立細胞學說的基礎上，1902年德國植物生理學家Haberlandt提出了高等植物的組織和器官可以不斷分割，直到單個細胞，并可以通過培養把植物的體細胞培養成為人工胚，每個細胞都像胚胎細胞那樣可以通過體外培養成為一棵完整的植株。
1904年，德國植物胚胎學家Hanning對蘿卜和辣根的胚進行培養，使其提早長成了小植株。1922年，Haberlandt的學生Kotte和美國的Robbins采用無機鹽添加糖及各種氨基酸的培養基對豌豆、玉米、棉花等的根尖與莖尖進行培養，結果形成了缺綠的葉和根，能進行無限的生長。1925年，Laibach將亞麻種間雜交不能成活的胚取出培養，使雜種胚成熟，繼而萌發成雜種植株。
1934年，美國植物生理學家White用無機鹽、糖類和酵母提取物的培養基，進行番茄根尖培養，建立了第一個活躍生長的無性繁殖系，并能無限地繼代培養，取得了離體根培養的真正成功。在以后的28年間轉接1600代仍能生長，并利用根系培養物研究了光照、溫度、pH、培養基組成對根生長的影響。接著，他用3種B族維生素――吡哆醇（維生素B6）、硫胺素（維生素B1）和煙酸（維生素B3）代替了酵母提取物，于1937年配制成適合根培養的White 綜合培養基，發現了B 族維生素對離體根生長的重要性。
法國的Gautheret（1934）在培養基中加入B族維生素和生長素后，山毛柳形成層生長并形成愈傷組織。Nobecourt培養胡蘿卜根，發現中央髓部細胞分裂活性很強，細胞增殖甚快，愈傷組織每4~6 周轉接一次，可無限繼代下去，這是首次從液泡化的薄壁細胞中建立的愈傷組織培養物。
在這個時期，White、Gautheret、Nobecourt等的出色工作，建立了植物組織培養的綜合培養基，包括無機鹽成分、有機成分和生長刺激因素。同時也建立了進行植物組織培養的基本方法，其成為當今各種植物組織培養的技術基礎。White于1943年出版了《植物組織培養手冊》，這是第一部有關植物組織培養技術的專著。
1948年，Skoog和我國學者崔在煙草髓培養研究中，發現腺嘌呤或腺苷可以解除培養基中生長素（IAA）對芽的抑制作用，并誘導成芽，從而發現了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根分化的決定性因素之一。隨后，在尋找促進細胞分裂的物質中，Miller 等發現了激動素（KT），它和腺嘌呤有相同的作用，且效果更好，比腺嘌呤活性高3萬倍。Skoog和Miller（1957）提出植物激素控制器官形成的概念，指出在煙草髓組織培養中，根和芽的分化取決于細胞分裂素及生長素的相對濃度，其比例高時促進芽的分化，比例低時促進生根。這一概念至今被人們所接受。
Steward和Reinert在1956年進行了胡蘿卜根愈傷組織的液體培養，其游離組織和小細胞團的懸浮液可以進行長期繼代培養。他們于1958年將胡蘿卜的懸浮細胞誘導分化成完整的小植株，并且開花結實。使50余年前Haberlandt細胞全能性假說首次得到科學的驗證，這一成果大大加速了植物組織培養研究的發展。
1960年，Morel 培養蘭花的莖尖，發現其培養方法可以脫除病毒，并能快速繁殖蘭花。其后植物離體微繁殖技術和脫毒技術得到快速發展。
1964年，Guha和Mabeshwari成功地從曼陀羅花藥培養中誘導出單倍體植株。隨后，Kameya和Hinata于1970年用懸滴法培養甘藍×芥藍雜種一代的成熟花粉，從單花粉培養中獲得了單倍體植株。從而促進了植物單倍體細胞育種技術的發展。我國朱至清等（1975）設計的N6培養基，適合水稻和其他禾本科植物花藥培養，在世界各國得到應用，促進了花藥培養的研究。
1960年，Cocking利用纖維素酶和果膠酶酶解細胞壁獲得高產量的原生質體以后，原生質體培養發展起來。1971年，Takebe和Nagata對煙草葉肉細胞原生質體進行培養，6周后把形成的小細胞團轉移到分化培養基上，3~4周后分化出大量的芽，最后誘導出根，首次從原生質體培養中獲得再生植株。
1972年，Carlson用NaNO3作融合劑，使粉藍煙草和郎氏煙草原生質體融合，首次獲得兩個煙草種間體細胞雜交株。Melchers等（1978）獲得了馬鈴薯和番茄的屬間體細胞雜種，而且該雜種具有耐寒性。
三、植物基因工程與分子標記技術的發展
基因工程的出現是建立在幾個重大發現和發明基礎上的。
1953年，Watson 和Crick 發現了DNA 雙螺旋結構，闡明了遺傳信息傳遞的中心法則，使得人們對基因的本質有了越來越多的認識，也奠定了基因工程的理論基礎。
1972年，美國斯坦福大學P.Berg 博士的研究小組使用限制性內切核酸酶EcoR I，在體外對猿猴病毒SV40 DNA和λ噬菌體DNA分別進行酶切，然后用T4 DNA連接酶將兩種酶切片段連接起來，第一次在體外獲得了包括SV40和λDNA的重組DNA分子。
1973年，S.Cohen 等將兩種分別編碼卡那霉素和四環素的抗性基因相連接，構建出重組DNA分子，然后轉化大腸桿菌，獲得了既抗卡那霉素又抗四環素的具雙重抗性特征的轉化子菌落，這是第一次成功的基因克隆實驗，基因工程也由此宣告產生。
植物基因工程對植物育種的作用有間接作用和直接作用。間接作用是篩選分子標記和構建分子標記遺傳圖譜，為植物育種提供參考。直接作用就是對植物基因進行遺傳操作。
1974年，Grodzicker 等第一次將限制性片段長度多態性（RFLP）用作腺病毒溫度敏感突變型的遺傳標記。1980年D.Botstein 等首次提出用RFLP 構建人類遺傳學連鎖圖，就是利用限制性內切核酸酶酶解DNA片段后，產生若干不同長度的小片段，其數目和每一片段的長度反映了DNA 限制位點的分布，其可作為某一DNA 的特有指紋。
1983年，首批轉基因植物（煙草、馬鈴薯）問世。
1986年，Powell-Abel等首次獲得抗煙草花葉病毒（TMV）的轉基因煙草植株，其展現了轉基因植物應用的喜人前景，植物基因工程隨即進入快速發展時期。
1989年，簡單序列重復多態性（SSR）技術產生。1990年，Weber報道人類DNA中存在短的串聯重復序列。微衛星是由2~6bp 的重復單位串聯而成，一個微衛星長度一般小于100bp。不同品種或個體核心序列的重復次數不同，但重復序列兩側的DNA序列是保守的，利用與核心序列互補的引物，通過PCR擴增和電泳可分析不同基因型個體在每個SSR 位點上的多態性。
1990年，Willians 和Welsh 等分別研究并提出隨機擴增多態性DNA（RAPD）技術。就是用一個（有時用兩個）隨機引物（一般8~10個堿基）非定點地擴增基因組DNA得到一系列多態性DNA片段，然后電泳檢測其多態性。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結合區域發生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導致引物結合位點的分布發生相應變化，使PCR 產物增加、減少或發生分子質量變化，產生RAPD 標記。
1992年，由荷蘭Keygene 公司科學家Zabeau 和P. Vos 發明了擴增片段長度多態性（AFLP）技術，并于1993年獲得歐洲專利局專利。此技術結合了RFLP 技術的可靠性和PCR 技術的高效性，具有DNA 用量少、靈敏度高，且不需要預先知道基因組的信息等優點。
1993年，首例轉基因植物產品（耐儲存番茄）進入市場。
1993年，我國第一例轉基因作物抗病毒煙草進入大田實驗。
1996年，E. Lander 提出單核苷酸多態性（SNP）。它是對某特定區域的核苷酸序列進行測定，將其與相關基因組中對應區域的核苷酸序列進行比較，檢測出單個核苷酸的差異，這個有差異的DNA 區域稱為SNP 標記。SNP 標記在大多數基因組中存在較高的頻率、數量豐富，可進行自動化檢測。
四、發酵工程的發展
直到19 世紀中葉，巴斯德通過著名的Pasteur 實驗，證明了發酵原理，指出發酵現象是微小生命體進行的化學反應。隨后，他連續對當時的乳酸發酵、乙醇發酵、葡萄酒釀造、食醋制造等各種發酵現象進行研究，明確了這些不同類型的發酵是由形態上可以區分的各種特定的微生物引起的。他指出，“乙醇發酵是由于酵母的作用，葡萄酒的酸敗是由酵母以外的另一種更小的微生物（乙酸菌）的第二次發酵作用所引起的”，隨之發明了著名的巴氏消毒法。巴斯德也因此被人們譽為“發酵之父”。
1872年，Brefeld創建了霉菌的純粹培養法；1878年，Hansen建立了啤酒酵母的純粹培養法；1872年，Koch建立了細菌純粹培養技術，從而確立了單種微生物的分離和純粹培養技術，使發酵技術從天然發酵轉變為純粹培養發酵。為此，人們設計了便于滅除其他雜菌的密閉式發酵罐及其他滅菌設備，開始了乙醇、甘油、丙酮、丁醇、乳酸、檸檬酸、淀粉酶和蛋白酶等的微生物純種發酵生產，與巴斯德以前的自然發酵是兩個迥然不同的概念。
1929年，Fleming發現了青霉菌能抑制其菌落周圍的細菌生長的現象，并證明了青霉素的存在。其后在1940年，Chain和Florey兩位博士精制出青霉素，并確認青霉素對傷口感染癥比當時的磺胺藥劑更有療效，加上第二次世界大戰爆發，青霉素作為醫治戰傷感染的藥物大力推動了青霉素的工業化生產和研究，成功創立了液態深層發酵技術。
1956年，日本的木下祝郎弄清了生物素對細胞膜通透性的影響，在培養基中限量提供生物素影響了膜磷脂的合成，從而使細胞膜的通透性增加，谷氨酸得以排出細胞并大量積累。1957年，日本將這一技術應用到谷氨酸發酵生產中，從而首先實現了谷氨酸的工業化生產。
20世紀70年代成功地實現了基因的重組和轉移。隨著重組技術的發展，人們可以按預定方案把外源目的基因克隆到容易大規模培養的微生物（如大腸桿菌、酵母菌）細胞中，通過微生物的大規模發酵生產，即可得到原先只有動物或植物才能生產的物質，如胰島素、干擾素、白細胞介素和多種細胞生長因子等。從過去煩瑣的隨機選育生產菌株朝著定向育種轉變，這使發酵工程進入了定向育種的新階段，新產品層出不窮。
第三節 農業生物技術的特點
生物技術是21世紀高新技術革命的核心內容。農業生物技術以生命科學領域的重大理論和技術突破為基礎，多學科相互滲透，呈現明顯的高新技術特點。
一、重大理論和技術突破，推動農業生物技術發展
從農業生物技術的發展進程可以明顯看出，每項農業生物技術的建立和發展，均伴隨著重大理論和技術的突破。DNA雙螺旋結構模型的建立，遺傳密碼的破譯，限制性內切核酸酶和DNA連接酶的發現，形成基因工程技術；細胞培養方法和原生質體融合方法的建立，形成細胞工程技術；生物反應器及傳感器的發明和自動化控制技術的應用，形成發酵工程技術等。
二、農業生物技術呈現明顯的高新技術特征
農業生物技術是滿足農業生產和人類生活需求的高新技術，是一個國家農業生產發展水平的重要標志。它具有高度的創新性、綜合性、滲透性，知識技術與人才的聚集性、資本密集性和增值性等高新技術特征。農業生物技術的理論研究和技術應用都已取得了顯著的成效，高科技的產業化格局已經基本形成，這將為農業生產發展帶來根本性變化。
三、農業生物技術是以基因工程為核心的綜合技術
農業生物技術是以基因工程為核心的綜合技術，它們彼此之間相互聯系、相互作用、相互影響、相互滲透，促進了農業生物技術整體水平的發展和提高。