臨床生物化學檢驗實驗指導（簡體書）

《臨床生物化學檢驗實驗指導》是全國高等院校醫學實驗教學規劃教材之一，全書共4章53個實驗。第一章是基本技能實驗，重點介紹實驗室的一些基本知識和臨床生物化學檢驗基本技術。第二章是常規應用實驗，重點介紹體液蛋白質、脂類及脂蛋白、糖及其代謝物、非蛋白含氮化合物、酶類、血氣分析、無機離子及微量元素和心肌標誌物的檢測。第三章是綜合應用實驗，包括方法學評價實驗、試劑盒性能評價實驗、儀器性能評價實驗和質量控制。第四章是設計創新實驗，包括動物模型的建立、臨床常見疾病的實驗診斷方案的設計等。本書以臨床生物化學檢驗基本技能實驗和常規應用實驗為主，強調臨床生物化學檢驗的基礎知識與基本操作技能，在此基礎上增加了綜合應用實驗和設計創新實驗內容，具有較強的臨床實用性。《臨床生物化學檢驗實驗指導》可供高等院校醫學檢驗專業、衛生檢驗專業學生實驗使用，也可供從事臨床檢驗工作和醫學研究的技術人員參考使用，並可用作臨床醫學、醫學影像學、麻醉學、法醫學、預防醫學以及藥學專業實驗教學的參考用書。·

《全國高等院校醫學檢驗專業實驗教學規劃教材:臨床生物化學檢驗實驗指導》由科學出版社出版。

第一章　臨床生物化學檢驗基本技能實驗
第一節　實驗室基本知識
一、實驗用玻璃器皿的清洗、使用和校正
二、移液器的使用和校正
三、臨床生物化學檢驗實驗用水
第二節　臨床生化檢驗基本技術
一、光譜技術
實驗1 721分光光度計性能檢查及校正
二、電泳技術
實驗2 血清蛋白聚丙烯醯胺凝膠圓盤電泳
實驗3 乳酸脫氫酶同工酶乙酸纖維素薄膜電泳
三、層析技術
實驗4 氨基酸雙向紙層析
實驗5 離子交換層析分離血清蛋白質
四、製備純化技術
實驗6 動物肝臟RNA的製備
實驗7 核酸樣品含量測定
第三節　臨床生物化學檢驗實驗報告的書寫
一、實驗報告的書寫要求
二、實驗報告的書寫內容
三、實驗報告書寫的必要性和重要性

第二章　臨床生物化學檢驗常規應用實驗
第一節　化學法測定實驗
實驗8 雙縮脲法測定血清總蛋白
實驗9 溴甲酚綠法測定血清清蛋白
實驗10 果糖胺法測定糖化血清蛋白
實驗11 重氮法測定血清總膽紅素和結合膽紅素
實驗12 苦味酸固定時間法測定血清肌酐
第二節　酶促反應法測定實驗
實驗13 氧化酶法測定血清（漿）葡萄糖
實驗14 氧化酶法測定血清甘油三酯
實驗15 氧化酶法測定血清總膽固醇（TC）
實驗16 勻相法測定血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）
實驗17 勻相法測定血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）
實驗18 過氧化物酶指示系統法測定血清尿酸
實驗19 脫氫酶指示系統法測定血清尿素
實驗20 脫氫酶指示系統法測定血清肌酐
實驗21 酶激活法測定血清鈣、磷、鎂離子
實驗22 酶循環法測定血清總膽汁酸
實驗23 連續監測法測定血清丙氨酸氨基轉移酶
實驗24 色素原底物法檢測鹼性磷酸酶
第三節　電化學法測定實驗
實驗25 離子選擇性電極法（ISE）測定血清鈉、鉀、氯離子
實驗26 血氣分析
第四節　免疫化學法測定實驗
實驗27 酶聯免疫吸附法（ELISA法）測定肌酸激酶及其同工酶
實驗28 心肌肌鈣蛋白T測定（電化學發光法）
實驗29 心肌肌紅蛋白檢測（免疫比濁法）
實驗30 透射比濁法測定尿微量清蛋白
實驗31 免疫比濁法測定血清胱抑素C
實驗32 免疫透射比濁法測定脂蛋白（a）
第五節　層析法測定實驗
實驗33 柱層析法測定糖化血紅蛋白

第三章　臨床生物化學檢驗綜合應用實驗
第一節　方法學評價實驗
實驗34 方法比較試驗
買驗35 回收試驗
實驗36 干擾試驗
實驗37 批內重複性實驗
實驗38 檢測限實驗
實驗39 線性範圍試驗
實驗40 方法性能判斷實驗
第二節　臨床生化檢驗試劑盒性能評價實驗
實驗41 線性範圍實驗
實驗42 時間反應曲線實驗
實驗43 穩定性實驗
實驗44 準確度和精密度實驗
第三節　臨床生化檢驗儀器性能評價實驗
實驗45 自動生化分析儀的性能評估實驗
第四節　臨床生物化學檢驗質量控制
實驗46 臨床化學檢驗室內質量控制
實驗47 臨床化學檢驗室間質量評價（EQA）

第四章　臨床生物化學檢驗設計創新實驗
實驗48 家兔乙醇代謝速率模型的建立與測定
實驗49 血清肌酐測定的干擾評價
實驗50 1型糖尿病動物模型的建立
實驗5l 小鼠急性肝損傷的模型建立與檢測
實驗52 急性腎小球腎炎實驗室診斷方案的設計
實驗53 糖尿病酮症酸中毒實驗室診斷方案的設計

附錄
附錄一　臨床生物化學檢驗常用緩衝溶液的配製
附錄二　常用生化檢驗英文縮寫術語
參考資料·

第一章　臨床生物化學檢驗基本技能實驗
臨床生物化學檢驗是生物化學、病理學、生物醫學技術和臨床醫學等學科互相滲透、不斷發展，逐步形成的一門理論性和實踐性的獨立學科，是檢驗醫學專業的主干課程之一。臨床生物化學檢驗與臨床實踐緊密結合，通過對人體生物樣本進行檢測，為臨床疾病的預防、診斷、病情監測、療效觀察和預后判斷等提供重要信息。臨床生物化學檢驗的教學內容包括理論教學和實驗教學兩部分，實驗教學重在訓練學生的實踐操作能力，這種能力對臨床檢驗測定結果的準確性和可靠性至關重要。為了達到實踐教學目的，提高實驗教學效果，使學生能夠更好地掌握本課程的基礎理論、基本知識和基本技能，本章重點介紹實驗室的一些基本知識和臨床生化檢驗基本技術。
第一節　實驗室基本知識
實驗室基本知識包括實驗室的安全知識、純水的制備與檢測、試劑的等級標準及試劑的配制、常用實驗器材的使用和維護等。實驗室安全知識已在臨床微生物學與檢驗教學中介紹，本節主要介紹實驗用玻璃器皿的清洗、使用和校正，移液器的使用及校正和臨床生物化學檢驗實驗用水。
一、實驗用玻璃器皿的清洗、使用和校正
實驗用玻璃器皿分為容器類和量器類。容器類玻璃器皿為常溫或加熱條件下物質的反應容器以及儲存容器，如試管、燒杯、錐形瓶、試劑瓶等。量器類玻璃儀器用于計量溶液體積，如量筒、容量瓶、吸量管、移液管、滴定管等。
（一）玻璃器皿的清洗與干燥
玻璃器皿的清潔程度直接影響測定結果的準確性。根據不同的實驗目的，使用不同的玻璃器皿，選用不同的清洗劑進行清洗，達到玻璃器皿清潔透明，沖洗水沿器壁自然下流時無掛水珠現象。
1.新購買玻璃器皿的清洗　新購買玻璃器皿的表面常附有游離的堿性物質，在包裝、運輸過程中可能有污物，可先用自來水洗刷至無污物，0.5%的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1%~2%的鹽酸溶液中過夜（至少4小時），再用自來水洗凈，最后用去離子水沖洗兩到三次，倒放在架子上備用。
2.使用過玻璃器皿的清洗
（1）容器類玻璃器皿：該類玻璃器皿使用后應及時倒掉內容物，然后用自來水清洗以免黏污物干涸。清洗時先用自來水刷洗至無污物，后用合適的洗滌液洗刷器皿內外壁，自來水流水沖洗，蒸餾水沖洗2~3次，烤干或倒置在清潔處。
（2）量器類玻璃器皿：該類玻璃器皿使用后應立即浸泡于自來水中以免黏污物干涸。清洗時用流水沖洗附著的試劑、蛋白質等物質，晾干，鉻酸洗液中浸泡4~6小時或過夜，自來水沖洗干凈，蒸餾水沖洗2~4次，晾干備用。
（3）比色皿：使用完畢立即用清水反復沖洗干凈，若附著有污物沖洗不凈，可用鹽酸或適當溶劑清洗，再用自來水反復沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗干凈，倒置于干凈濾紙上晾干備用。注意為防止損壞比色皿的透光度，勿用試管刷或粗糙的紙或布擦拭；勿用強堿或強氧化劑清洗。
（4）特殊玻璃器皿：污染過血、尿等標本的試管清洗時，應在消毒液（如重鉻酸鉀或煤酚皂溶液）中浸泡過夜進行消毒，再按常規方法清洗。被石蠟、凡士林或其他油脂類污染的玻璃量器要單獨洗滌，洗滌前先除去油脂再按常規方法清洗。染料污染的玻璃器皿，先用清水清洗，再置于重鉻酸鉀清潔液或稀鹽酸中浸泡以徹底去除附著的染料，然后按常規方法清洗。用于微量元素測量的玻璃器材應單獨清洗，先用稀硝酸浸泡再用去離子水沖洗，然后按照一般方法清洗。
3.幾種清洗液的配制和應用
（1）清潔液（重鉻酸鉀清潔液）：重鉻酸鉀1000g，加熱水2L并攪拌使之溶解，冷卻后緩慢加入濃硫酸10L，混勻即可。注意加入硫酸時，速度不能過快，以免產生高熱而使容器破裂。由于硫酸吸濕性強，可吸收空氣中水分而變稀，用后應及時加蓋。清潔液的顏色由棕黃色變為綠色，其清潔效力降低，再加入適量的重鉻酸鉀和濃硫酸可繼續使用，若變成黑色則不能再用，應重新配制。
（2）乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）洗液：50~100g/L的EDTA-Na2溶液，加熱煮沸可清洗玻璃器皿內壁的白色沉淀物如鈣、鎂鹽類和不易溶解的重金屬鹽類。
（3）其他特殊洗液：草酸洗液可洗脫高錳酸鉀的痕跡，硫代硫酸鈉洗液可去除碘液污染，7.5mol/L尿素洗液可除去黏附在器皿上的血液或血清蛋白。
（二）玻璃器皿的使用
1.量筒　量筒一般用于不太精密的液體計量，使用時根據需要選擇不同量程的量筒。如取用8ml時，應選用10ml量筒（誤差±0.1ml）。讀取量筒刻度值時，一定要使視線與量筒內液面處于同一水平線上，以免增加量取誤差。量筒不能做反應容器，不能裝熱的液體。
2.容量瓶　容量瓶為細頸梨形的平底瓶，一般用于將精密稱量的固體試劑或一定濃度的濃溶液配制成準確濃度的溶液。瓶頸上有環形標線，標示指定溫度時液體的容積。容量瓶與瓶塞配套使用，使用前檢查是否漏水。注意容量瓶不能長期存放溶液，不能在烤箱中烘烤，不許以任何形式對其加熱。
3.吸量管　吸量管一般用于準確量取一定體積的液體，可分三類：奧氏吸量管、移液管和刻度吸量管。
（1）奧氏吸量管：準確性最好，尤其適用于黏稠液體的量取，常用規格有0.5ml、1.0ml、2.0ml和3.0ml等。此種吸量管只有一個刻度，當放出所量取的液體時，管尖殘留的液體須吹入容器內。
（2）刻度吸量管：主要用于量取10ml以下任意體積的溶液，分全流出式和不完全流出式兩種。完全流出式的上端常標有吹字，刻度包括尖端部分，欲將所取液體全部放出時，應將管尖的液體吹出。另一種吸量管的刻度不包括管尖部分，放液時至相應刻度線處即可。
吸量管使用應規范。移取液體時，用右手的大拇指和中指拿住管上方，食指向上配合左手操作。吸量管插入液體中1~2cm ，左手用洗耳球慢慢將液體吸入管內。當液面升高到刻度以上時，立即用右手食指按住管口，將吸量管下口提出液面，略微放松食指使液面平穩下降，直到溶液的彎月面與標線相切時，食指立即壓緊管口使液體不再流出。放出液體時，將吸量管末端外壁的溶液用干凈濾紙擦去，然后使管末端靠在器皿內壁上，松開食指，讓管內液體自然沿器壁流下，待15秒左右拿出吸量管。
（3）移液管：一般用來準確量取較大體積液體，常用規格有50ml 、25ml 、10ml 、5ml 、2ml 和1ml 等。用移液管量取液體時，量取的液體自然流出后，管尖需在盛器內壁停留15秒左右。管尖殘留的液體不要吹出。
（4）燒杯：常用于盛放液體、加熱和溶解試劑，常與容量瓶配合使用。使用時切勿用手接觸其內壁，溶解或混勻試劑時可用玻璃棒輕輕攪拌混勻。燒杯內溶液倒入容量瓶時，注意用溶液多次沖洗燒杯，一并傾入容量瓶內。
（5）漏斗：多用于過濾和收集沉淀物。在定量分析時，選用大小合適的濾紙，對角折疊兩次后1∶3分開放入漏斗內，紙的邊緣不能超出漏斗上緣。濾紙大小與過濾液體量應相配，過大使濾液回收減少，所含成分濃縮而影響其效果。
（三）常用玻璃器皿的校正
在校正量器之前，須先熟悉它們的正確使用方法，校正方法與實際工作中的使用方法一致。校正時，所用蒸餾水至少在室內放置1小時以上，校正儀器應仔細洗滌至內壁完全不掛水珠，如室溫變化須記錄水的溫度，在開始放水前，滴定管或移液管尖端與外面的水必須除去。
1.校正量器的方法　校正方法一般通過量器在某溫度時所容納水或水銀的重量來推算其體積。因此，校正時必須考慮三個因素，即溫度對量器的影響，溫度對水或水銀密度的影響，空氣浮力對水重量的影響，其中溫度對水密度的影響最大。校正時的溫度應盡量接近實驗室全年平均溫度（一般為20℃）。
校正的基本程序：稱出量器容納的水重，根據以下公式換算為體積。W20＝Wt/r，Wt為某一溫度下所稱得的水重，r為某溫度時充滿容量為1L 的玻璃量器的水的重量（表1-1）。
例如：容器為1L 的量瓶在20℃校正時，稱得水重為998.06g ，從表1-1查得20℃時r值
為997.15，則該量瓶在20℃時的真實容量為：V20＝1000×（Wt/r）＝1000×（998.06/997.15）＝1000.91（ml），校正值為1000.91-1000＝+0.91ml
2.校正吸量管的方法　一般0.2ml以上吸量管均可用水稱量法校正。將吸量管洗凈，干燥，吸取蒸餾水至標線以上，緩緩調節液面弧形至標線，將水放入已稱量的具塞錐形瓶中，再稱量，兩次重量之差為水的重量，以實驗溫度時每毫升水的重量來除水重，即得吸量管的真實體積。若在允許誤差范圍內即為合格，超過允許誤差則棄之或重新刻度。
3.校正容量瓶的方法　將洗凈的容量瓶在室溫晾干，稱空瓶重，注入蒸餾水至標線再稱重，兩次重量之差即為瓶中水重，以實驗溫度時每毫升水的重量來除水重，即得吸量管的真實體積。
二、移液器的使用和校正
移液器又稱移液槍、微量加樣器，加樣精確，按原理主要有空氣墊式加樣器和活塞正移動式加樣器兩種。移液器是量出式量器，分為定量移液器和可調移液器兩大類。移液器主要由顯示窗、容量調節部件、活塞、活塞套、吸引管和吸液嘴等部分組成。
1.移液器的使用方法
（1）量程選擇：移液器能在特定量程范圍內準確移取液體，使用時如果超出最小或最大量程，會損壞加樣器并導致計量不準。
（2）設定體積：刻度調節系統一般由3個數字組成。正常調節方法是從大量程調節至小量程。從小量程調節至大量程時，應先調至超過設定體積刻度，再回調至設定體積，這樣可以保證移液器的準確性。
（3）吸頭安裝：選擇合適吸頭，將移液槍垂直插入吸頭，左右旋轉半圈上緊。
（4）預洗吸頭：吸樣前應預洗吸頭，先輕輕吸打幾次液樣，可消除吸液誤差。
（5）吸液：將按鈕按至第一檔，吸頭垂直浸入液面2~3mm ，慢慢吸入液體，停留1s 將吸頭提離液面，用吸紙抹去吸嘴外面可能黏附的液滴。勿觸及吸頭口。
（6）放液：將吸頭口貼到容器內壁并保持10°~40°傾斜，將按鈕按至第一檔，停1~2s 后，繼續按壓至第二檔，排除殘余液體。松開按鈕，同時提起移液器。
（7）按吸頭彈射器棄去吸頭。
2.移液器的校正　為保證加樣的準確性，需要定期對移液器進行校準。校準可按以下程序進行。
（1）校正前準備：室溫應控制在20~25℃，波動范圍不大于±0.5℃。電子天平放置于無塵和震動影響的臺面上，天平內放置一盛蒸餾水的小燒杯以保持濕度。另外需要5~10ml 體積的小燒杯一只，溫度20~25℃的雙蒸水。
（2）校準步驟：將移液器調至擬校準體積，選擇合適吸頭，調節好天平，來回吸吹蒸餾水3次以使吸頭濕潤，移液器吸取蒸餾水，將蒸餾水完全打入稱量燒杯中，記錄稱量值，并按以上步驟稱量10次，取10次測量值的均值，按蒸餾水Z因子計算體積，最后按校準結果調節移液器。
三、臨床生物化學檢驗實驗用水
水是實驗室最常用的溶劑，天然水中含有許多雜質，須經過蒸餾、電滲析等處理，除去雜質才可作為實驗用水。實驗用水的質量高低直接影響試劑質量和實驗結果的準確性和精密性。2008年中國制定了實驗室用水國家標準，1985年美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）提出了實驗用水的標準。
一般性實驗選用Ⅱ級水，特殊實驗如酶活性測定、電解質分析等應選用Ⅰ級水，Ⅲ級水用作儀器、器皿的自來水清潔后沖洗。
（一）純水的制備方法和儲存方法
1.純水的制備方法
（1）蒸餾法：蒸餾水是利用水與雜質的沸點不同，經蒸餾器蒸餾制得。將自來水或天然水在蒸餾器中加熱氣化，然后冷凝水蒸氣得蒸餾水。蒸餾法制純水的優點是操作簡單、成本低、效果好，適用于用水量較少的中、小廠礦和實驗室使用。用于純水制備的蒸餾器有多種。實驗室用純水可用玻璃或金屬蒸餾器進行蒸餾制得。特殊用途的高純水可用硬質玻璃、石英、銀、鉑或聚四氟乙烯等材質的蒸餾器進行蒸餾制得，一般化學分析用的蒸餾水通常是通過一次蒸餾的方法制得，稱為一次水。精密分析或測定高純物質時所用的純度較高的水，可用普通蒸餾器增加蒸餾次數或減慢蒸餾速度的方法制得。
（2）離子交換法：通過離子交換樹脂精制的純水稱為離子交換水或去離子水。由于離子交換樹脂去離子能力強，水質良好，出水量大，成本低，操作技術易掌握等優點，適合于各種規模的實驗室采用。在用水量大的場合有替代蒸餾法制備純水的趨勢。
離子交換法是通過離子交換樹脂過濾，水中的離子與樹脂上的離子發生交換使水得到凈化的方法。實驗室用純水的制備程序一般分為兩步：硬水軟化和去離子。硬水軟化是指在用樹脂交換離子之前，先將水質硬度降低到一定程度的一種前處理工藝。去離子是利用離子交換樹脂中的氫離子交換水中的陽離子，以氫氧根離子交換水中的陰離子。目前，國內外相關去離子水的制備技術和設備已經很成熟，去離子水設備有現成的商品可以買到。
（3）電滲析法制取純水：電滲析純化水是除去水中的電解質，又叫電滲析脫鹽。電滲析純化水的原理是利用離子交換膜的選擇性透過，即陽離子交換膜（簡稱陽膜）僅允許陽離子通過，陰離子交換膜（簡稱陰膜）僅允許陰離子通過，在外加直流電場作用下，使一部分水中的離子通過離子交換膜遷移到另一部分水中，造成一部分水淡化，另一部分水濃縮，收集淡化水即為純化水。
電滲析法對弱電解質去除效率較低，常用于海水淡化，不適用于單獨制取分析用純水。電滲析法與離子交換法聯用，可制得較好的分析用純水。電滲析法的優點是設備可自動化，節省人力，僅消耗電能，不消耗酸堿，不產生廢酸等。
（4）活性炭吸附法：活性炭吸附法是采用活性炭柱處理自來水以除去有機物的方法。原理是利用活性炭過濾器的空隙大小，即有機物通過孔隙時的滲透率來達到去除有機物的目的。
（5）超濾膜法：超濾膜法是采用超濾的方法除去水中懸浮物的方法，所得水仍需進一步純化。
（6）純水器：目前多采用該法制備純水。它把純化水技術的工作原理有效地集中在一臺純水機上，基本工藝是水經過濾膜預處理后，結合碳吸附和離子交換處理，最后以孔徑0.45μm 的濾膜除去微生物。
2.純水的儲存方法　在實際工作中應重視純水的儲存、運輸和使用過程，以免純水等級下降。一般選用聚乙烯或聚丙烯桶或瓶儲存，儲存時間不宜太長。使用時應避免儀器可能的污染，切勿用手接觸純水或容器內壁。
（二）水的純度檢測
1.標準檢測方法　標準檢測方法要求嚴格精確，一般用于精密分析實驗和科學研究用水。
（1）pH 范圍：純水質量標準中對一、二級水的pH 未作具體規定，原因是純水幾乎不導電，在一、二級水的純度下，很難準確測定其pH 。
（2）電導率：測一、二級水時，電導儀的電極常數應在0.01~0.1cm-1。測三級水時，電導儀的電極常數應在0.1~1cm1。應使用具有溫度補償功能的電導儀，“在線”測定一級和二級水的電導率。如果使用的電導儀不具有溫度補償功能，則應裝有“在線”熱交換器，使實驗時水溫能控制在（25±0.1）℃。
（3）可氧化物質：用高錳酸鉀滴定法來測定純水中可氧化物的含量。高錳酸鉀滴定液呈紫紅色或粉紅色，具有強氧化性，若水中有可氧化物時，其被還原成為近無色的溶液。據此可用于純水可氧化物含量測定。
（4）吸光度：用分光光度計來測定純水的吸光度值。將水樣分別注入1cm和2cm吸收池中，于254nm處以1cm吸收池中的水樣為參比，測定2cm吸收池中水樣的吸光度。若儀器靈敏度不夠，可適當增加測量吸收池的厚度。