病原生物與醫學免疫學實驗(第4版)（簡體書）

《病原生物學與免疫學實驗（第4版）》分為四部分,緒言主要介紹本門課程的教學目的和要求以及實驗室規則和實驗室生物安全;**篇主要介紹三門課程的基本實驗,包括醫學免疫學、病原生物學和人體寄生蟲學基本實驗項目,內容包括一些新的實驗技術;第二篇為綜合性和設計性實驗,該篇首先介紹了感染性疾病病原體的檢測方法和常用的用于病原體檢測的分子生物學實驗技術,其次羅列了經典的感染性疾病臨床病例,目的是在病例討論基礎之上,圍繞病原體的檢測,綜合運用所學的基礎知識和基本實驗技能設計實驗;第三篇是創新性實驗相關內容,主要介紹了國家創新創業實驗項目的目的和要求以及項目申請書的格式和內容,該篇主要針對一些對科學研究特別感興趣的同學。

《病原生物學與免疫學實驗（第4版）》適合醫藥院校臨床、預防、寄出、口腔、麻醉、影像、護理、中醫、藥學、檢驗等各專業、各層次學生的病原學免疫學實驗教學。

緒 言
一、 病原生物學與免疫學實驗目的和要求
(1) 通過實驗觀察和實驗操作，鞏固并加深對醫學免疫學和病原生物學基本理論知識的理解。
(2) 掌握病原生物學與免疫學的基本操作技術;樹立牢固的無菌觀念，掌握生物安全的基本知識和病原生物學中常見的無菌操作技術，為以后的臨床操作奠定堅實的基礎。
(3) 熟悉感染性疾病常用的診斷方法和手段，了解病原生物學和免疫學實驗技術的新進展。
(4) 培養學生具有從事科學實驗的能力，能夠獨立觀察實驗結果、整理分析實驗資料、總結書寫實驗報告和論文的能力。 培養學生一定的創新能力，能夠提出問題，分析問題并設計方案解決問題。 培養學生嚴謹的科學態度和作風，培養學生不僅具有獨立解決問題的能力，同時也培養學生團結協作精神。
二、 實驗室生物安全
國家根據病原微生物的傳染性、感染后對個體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類(表 0-1):
一類、二類病原微生物統稱為高致病性病原微生物。
根據微生物實驗室開展工作的性質、接觸的病原體生物危害程度、采取生物安全措施的不同分為 4 級(表 0-2)
三、 實驗室規章制度
病原生物學實驗的對象大多為病原微生物，有的具有一定的感染性，因此要求進入實驗室后必須嚴格遵守以下實驗室規則:
(1) 每次進入實驗室必須穿白大褂，不必要的物品不得帶入實驗室，必須帶入的書籍和文具等應放在實驗臺下的抽屜里，以免受到污染。
(2) 實驗室內禁止飲食、喝水、抽煙，不得高聲談笑或隨便走動，務必關閉手機鈴聲，上課期間不得使用手機。
(3) 各種實驗物品應按指定地點存放，用過的器材必須放入消毒缸內，禁止隨意放于桌上及沖入水槽。
(4) 須送培養箱培養的物品，應做好標記后送到指定地點。
(5) 實驗過程中發生差錯或意外事故時，應立即報告老師，并在老師的指導下進行正確的處理，禁止隱瞞或擅自處理。 如有傳染性的材料污染桌面、地面等，應立即用規定濃度的消毒液浸泡污染部位，作用 5 ~ 10min 后方可抹去。 如手被活菌污染也應使用合適濃度的消毒液浸泡 5 ~ 10min 后，再以自來水反復沖洗。
(6) 愛護室內儀器設備，嚴格按照儀器的操作規則使用，尤其是顯微鏡，使用油鏡頭后必須擦凈鏡油。 節約使用實驗材料，不慎損壞了器材等，應主動報告老師并進行相應清理。
(7) 實驗完畢，應物歸原處，并將桌面整理清潔，實驗室打掃干凈。 *后以消毒液浸泡手 5min，清水洗凈后方可離開實驗室。
**篇 基 本 實 驗
**章免疫學基本實驗
**節抗體的制備
抗體(antibody，Ab)是免疫系統在抗原的刺激下，B 淋巴細胞轉化為漿細胞，由漿細胞所產生的、能與相應抗原發生特異性結合的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。 抗體在疾病的診斷和防治中發揮重要作用，人工制備抗體是大量獲得抗體的重要途徑。 人工制備抗體的類型主要有多克隆抗體( polyclonal antibody，Pc Ab)、單克隆抗體( monoclonal antibody，Mc Ab)和基因工程抗體(gene engineering antibody，Ge Ab)。 本書主要介紹多克隆抗體和單克隆抗體的制備方法。
一、多克隆抗體
多克隆抗體(polyclonal antibody，Pc Ab) 是指多種抗原決定簇的抗原免疫動物，刺激機體多個 B 細胞克隆，產生針對多種抗原表位的不同抗體，所獲得的抗體為多種抗體的混合物，即多抗。 為制備高效價、高特異性的多克隆抗體，須有理想的免疫原、適宜的動物和可行的方法。 本書主要介紹大腸埃希菌抗血清制備的多克隆抗體。實驗 1-1 多克隆抗體的制備
【實驗目的】
制備高效價高特異性的免疫血清可為免疫學診斷特異性免疫治療和免疫學實驗提供常用的試劑。
【實驗原理】
將抗原導入敏感動物體內后，刺激其淋巴結和脾臟中的淋巴細胞等網狀內皮細胞系統大量增殖。 實驗動物對初次免疫和二次免疫的應答不同。 初次免疫應答較弱，特別是對易代謝，可溶性的抗原。 首次注射后 7d 左右，在血清中可以檢測到抗體，其濃度維持在一個較低水平;注射后 10d 左右抗體的滴度會達到**值。 這種抗體滴度增加，血清中抗體種類和性質發生改變稱為免疫應答的成熟，在抗體的制備過程中具有重要的實際意義。 通常在抗原注射 4 ~ 6w 后會產生具有高親和力的抗體。 免疫應答的動力學結果取決于抗原和免疫動物的種類，但初次和二次免疫應答之間的關系是免疫應答的一個重要特點。 三次或以后的抗原注射所產生的應答和二次應答結果相似。
【實驗材料】
家兔、大腸埃希菌、SS 平板、固體斜面培養基、固體營養培養基、接種環、酒精燈、玻璃過濾器、37℃培養箱、搖床恒溫水浴箱、離心機、振蕩器、滅菌大試管、毛細管、玻片、0． 5% 石炭酸溶液、硫柳汞溶液、飽和硫酸銨溶液、磷酸、鹽緩沖液、鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液、生理鹽水。
【實驗方法】
1．抗原的制備 從正常人群的糞便中分離出的大腸埃希菌作革蘭染色，革蘭染色陰性，符合糖發酵實驗陰性標準，SS 平板上菌落典型的菌才能作后續實驗。 將分離出的大腸埃希菌接種于固體斜面培養基純培養。 再將其接種于固體營養培養基平板，置 37℃ 培養箱培養 16 ~ 18h 后用無菌生理鹽水洗下菌苔，充分搖勻。 將此懸液作革蘭染色鏡檢，如未檢測到雜菌，將其加熱至 80℃ 30min，玻璃濾器濾過，上面得 O 菌液，下面得 H 菌液，將菌液稀釋至約 10 億/ m L 濃度，置 4℃冰箱待用。
2． 免疫方法 選擇并標記雄性家兔 10 只，O 菌液與 H 菌液各注射注射 5 只。
3． 血清制備 末次注射后 5 ~ 7d，從兔耳靜脈采血 2m L，分離血清。 用試管凝集定量法測定抗體效價，如效價達 1 ∶ 1 萬以上，則以無菌操作從兔心臟抽血，分離血清，于 56℃ 保溫30min，以滅活補體。 在血清中加入適量的 0． 5% 石炭酸作防腐劑，分裝成每小瓶 1 ~ 2m L，密封，做好標記，置于 4℃冰箱保存備用。
【實驗結果】
將免疫后收集的血液與注射前收集的血液進行比較，檢測是否有抗體產生及抗體的效價。 用抗大腸埃希菌 H、O 血清，作玻片凝集試驗，肉眼及鏡下觀察，該現象與傷寒桿菌凝集現象不易區分。 將 H、O 混合后血清適當稀釋代替傷寒病人血清，將大腸埃希菌 H、O 菌液代替傷寒菌液作肥達反應，其現象與臨床肥達反應不易區分。
【注意事項】
(1) 抗原的質量很關鍵，增強抗原的免疫原性不能破壞其本身的抗原表位;
(2) 混合抗體的制備需要適當選擇抗原簇以免制成的混合抗體不能檢出規定的細菌而造成漏檢;
(3) 制備抗原須滅活細菌，抗體制備須研究抗原的注射劑量、注射時間和取血時間，避免抗原制備失敗或抗體效價不理想;
(4) 若血清抗體效價檢測未達到要求，可加強免疫一次;
(5) 免疫后的動物要密切監測動物的身體狀況若出現超敏反應、皮膚潰爛等問題要及時處理。實驗 抗體的提取與純化(鹽析沉淀法)一般抗體提取與純化的操作程序是為多克隆抗體血清設計的，主要的方法有鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法與梯度離心法，在實際應用中多在抗體的產量與純度之間考慮一合理的方法。 本次實驗選用鹽析法，此法簡便，產量高，但純度稍差。
【實驗目的】
用鹽析法純化抗血清。
【實驗原理】
此法提取抗體，是根據蛋白質具有膠體性質，當蛋白質溶液中加入大量中性鹽類時，奪取蛋白質水化層使其脫水，并中和蛋白質所帶電荷，使蛋白質失去穩定因素而從溶液中沉淀出來，但并不引起蛋白質發生變性，此現象稱鹽析。 由于各種蛋白質析出時所要求鹽類濃度不同，因此在蛋白質溶液中加入不同濃度的中性鹽，能使各種成分蛋白質分別析出，達到分離提純抗體的目的。
【實驗材料】
飽和硫酸銨溶液(p H7． 0)、免抗人 Ig G 免疫血清、p H7． 4 0． 01mol/ L PBS(含 0． 14 mol/ LNa Cl)、奈氏試劑、透析袋、離心機、磁力攪拌器、小燒杯、離心管。
【實驗方法】
(1) 每組于小燒杯中加入抗血清 5m L、PBS 5m L，在攪拌器上邊攪拌邊逐滴緩慢加入飽和硫酸銨 10m L，逐漸發生混濁。 分裝 2 支 10m L 離心管，4℃ 30min 或過夜。
(2) 3000rpm 20 ~ 30min(** 4℃)，去上清，共用 5m L PBS 將兩支離心管的沉淀溶解并吸于一支離心管中。 加飽和硫酸銨 2． 5 m L 使其蛋白質沉淀，4℃30min(33% 硫酸銨飽和度)。 此步重復 1 ~ 2 次。
(3) 3000rpm 20 ~ 30min， 去 上 清， 用 少 量 PBS 溶 解， 吸 入 透 析 袋 內， 用 無 Na Cl0． 01mol/ L PBS 4℃ 透析去鹽，每天換液 3 次(在磁力攪拌下透析更快)，到除盡溶液中的NH4為止，約需 2 ~ 3d。 透析液 NH4的檢測用奈氏試劑，如產生黃色沉淀證明 NH4存在。
(4) 可用葡聚糖 G-25 或 G-50 凝膠過柱除鹽并進一步純化。
(5) 紫外分光光度計讀 OD280值，了解抗體蛋白質含量。 小量分裝，-20℃保存。
二、 單克隆抗體
單克隆抗體(monoclonal antibody，Mc Ab)是由淋巴細胞雜交瘤產生的、只針對復合抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。 單抗在結構和組成上高度均一，抗原特異性及同種型一致，易于體外大量制備和純化，故單抗具有純度高、特異性強、效價高、少或無血清交叉反應、制備成本低等特性，已廣泛應用于疾病的診斷、特異性抗原或蛋白的檢測和鑒定、疾病的被動免疫治療和生物導向藥物的制備等。要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆 B 淋巴細胞，但這種 B 淋巴細胞不能在體外生長。 而實驗發現骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖，應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞。 這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性，它既具有 B 淋巴細胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細胞培養增殖的細胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體(圖 1-1，彩圖)。圖 1-1 單克隆抗體制備過程示意圖(一) 抗原提純與動物免疫
對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。 如為細胞抗原，可取 1×107個細胞作腹腔免疫。 可溶性抗原需加完全福氏佐劑并經充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。選 擇 與 所 用 骨 髓 瘤 細 胞 同 源 的BALB/ c 健康小鼠，鼠齡在 8 ~ 12w，雌雄不限。 為避免小鼠反應而不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫 3 ~ 4 只小鼠。免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價抗體為*終目的。 免疫間隔一般 2 ~ 3w。 一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細胞產生高效價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質量(如抗體的濃度和親和力)也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關。 末次免疫后 3 ~4d，分離脾細胞融合。
(二) 骨髓瘤細胞及飼養細胞的制備
選擇瘤細胞株的*重要的一點是與待融合的 B 細胞同源。 如待融合的是脾細胞，各種骨髓瘤細胞株均可應用，但應用*多的是 Sp2 / 0 細胞株。 該細胞株生長及融合效率均佳，此外，該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。 細胞的**生長密度為 9×105/ m L，倍增時間通常為 10 ~ 15h。 融合細胞應選擇處于對數生長期、細胞形態和活性佳的細胞(活性應大