病原生物學實驗指導（簡體書）

《全國高等醫藥院校實驗教材:病原生物學實驗指導》將原屬於醫學微生物學實驗教學的內容和人體寄生蟲學實驗教學的內容進行了合理、科學的歸並和融合，在尊重原學科特點的基礎上主要做了以下改進：注重共性和個性的關系。本實驗指導中，尊重微生物和寄生蟲實驗個性特徵的同時，將二者共同的實驗內容部分匯總，總結出了實驗技術、分子生物學方法、免疫學方法等章節，減少了篇幅。在注重驗證基本原理，培養基本技能的基礎上，進一步密切結合臨床實際，刪除了部分已經被臨床檢驗淘汰的實驗，做到了基礎結合臨床。

第1篇 醫學微生物學
第1章 病原微生物實驗室生物安全
一、病原微生物分類及安全防護級別
二、病原微生物實驗室生物安全防護
三、生物安全標識
第2章 細菌的形態檢查
一、普通光學顯微鏡油鏡的使用和保護
二、細菌不染色標本檢查法
三、細菌的革蘭染色
四、細菌的基本形態和特殊結構觀察
思考題
第3章 細菌的生長與代謝
一、細菌培養基及制備
二、細菌的接種技術及培養物的觀察
三、細菌的培養方法
四、細菌的代謝產物檢查
五、數字編碼鑒定技術
思考題
第4章 外界因素對細菌代謝的影響
一、微生物分佈檢查
二、物理因素對細菌代謝的影響
三、化學因素對細菌代謝的影響
四、噬菌體裂菌試驗
思考題
第5章 細菌的遺傳與變異
一、細菌的形態變異
二、細菌的h—O變異
三、細菌的s—r變異
四、細菌的耐藥性變異（r質粒接合傳遞試驗）
思考題
第6章 病原菌致病作用及動物實驗
一、實驗動物的選擇原則及接種
二、肺炎鏈球菌致病性
三、細菌侵襲性酶的侵襲作用觀察
四、內毒素的致熱作用及內毒素檢測
五、外毒素致病和抗毒素中和試驗
思考題
第7章 病原性球菌
一、病原性球菌的形態觀察
二、病原性球菌血平板培養物觀察
三、血漿凝固酶試驗
四、抗鏈球菌溶血素“O”測定
五、膿汁標本中病原性球菌的分離與鑒定
思考題
第8章 胃腸道感染細菌
一、常見胃腸道定居或感染細菌的形態觀察
二、腸道桿菌的主要生化反應及菌落觀察
三、糞便標本中致病性腸道菌的分離和鑒定
四、肥達反應
第9章 厭氧性細菌
一、厭氧培養法
二、厭氧芽胞梭菌和無芽胞厭氧菌的形態觀察
三、破傷風梭菌和產氣莢膜梭菌培養物觀察
四、破傷風外毒素與抗毒素中和試驗
五、產氣莢膜梭菌的動物試驗
思考題
第10章 分枝桿菌
一、齊—尼（ziehl-neelsen）抗酸染色法和金胺“O”熒光染色法
二、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌的形態觀察
三、結核分枝桿菌的培養
思考題
第11章 其他病原菌
一、病原菌形態觀察
二、白喉棒狀桿菌培養物觀察
三、白喉棒狀桿菌的毒力試驗
四、銅綠假單胞菌培養物觀察
五、流感嗜血桿菌培養時的衛星現象觀察
思考題
第12章 其他原核細胞型微生物
一、螺旋體
二、支原體
三、衣原體
四、立克次體
五、放線菌
思考題
第13章 真菌學實驗
一、真菌的形態結構觀察
二、真菌的培養物觀察
三、真菌性皮屑的鏡檢
四、白假絲酵母菌芽管形成試驗
五、白假絲酵母菌厚膜孢子形成試驗
思考題
第14章 病毒學實驗
一、雞胚的接種和觀察
二、病毒的細胞培養法
三、病毒包涵體觀察
四、血球凝集和血球凝集抑制試驗
五、elisa法檢測患者血清乙肝表面抗原
六、pcr技術檢測乙型肝炎病毒
七、elisa法檢測hiv抗體
思考題
第2篇 人體寄生蟲學
第15章 線蟲
一、似蚓蛔線蟲
二、毛首鞭形線蟲
三、蠕形住腸線蟲
四、十二指腸鉤口線蟲與美洲板口線蟲
五、班氏吳策線蟲與馬來布魯線蟲
六、旋毛形線蟲
思考題
第16章 絳蟲
一、肥胖帶絳蟲
二、鏈狀帶絳蟲
三、細粒棘球絳蟲
四、微小膜殼絳蟲、縮小膜殼絳蟲
五、曼氏迭宮絳蟲
思考題
第17章 吸蟲
一、日本血吸蟲
二、華支睪吸蟲
三、衛氏並殖吸蟲
四、布氏薑片吸蟲
思考題
第18章 原蟲
一、阿米巴原蟲
二、藍氏賈第鞭毛蟲
三、陰道毛滴蟲
四、瘧原蟲
五、杜氏利什曼原蟲
六、剛地弓形蟲
七、隱孢子蟲
思考題
第19章 醫學節肢動物
一、蚊
二、白蛉
三、蠅
四、蚤
五、虱
六、蜱
七、蟎
思考題
第3篇 病原生物實驗室檢測技術
第20章 病原生物形態檢測及培養常用技術
一、細菌形態檢測技術
二、細菌培養技術
三、病毒形態檢測技術
四、病毒培養技術
五、真菌形態檢測技術
六、真菌培養技術
七、寄生蟲形態學檢測技術
八、原蟲培養技術
第21章 病原生物檢測常用免疫學技術
一、玻片凝集試驗
二、試管凝集反應
三、對流免疫電泳
四、血凝抑制試驗
五、酶聯免疫吸附試驗
六、蛋白印跡技術介紹
思考題
第22章 病原生物檢測常用分子生物學技術
一、細菌基因組dna制備
二、細菌dna中（g+c）mol%測定
三、多聚酶鏈式反應
四、細菌16s rRNA基因分析
五、dna晶片技術介紹
參考文獻

一、細菌培養基及制備
培養基（culture meditma）是將適合於細菌生長繁殖的各種營養物質用人工的方法配製成的營養基質。培養基含有所培養細菌必需的各種營養物質以及合適的pH，而且是無菌的。根據培養基的性質和用途可分為基礎培養基、營養培養基、鑒別培養基、選擇培養基和厭氧培養基。
培養基按物理性狀可分為液體、半固體和固體3大類。在液體培養基中加入賦形劑瓊脂（agar）可改變培養基的物理性狀。加入2％瓊脂，可制備成固體平板或斜面培養基。加入0.3％～0.5％瓊脂可制備成半固體培養基。
培養基的制備原則
（1）充足的營養物質：培養基必須含有細菌生長繁殖所需要的營養物質，有時候還需要根據培養細菌的特性加入特定的營養物質。
（2）合適的pH：培養基的pH應符合細菌生長要求，多數細菌生長的適宜pH值為7.2～7.6。有的細菌例外，如霍亂弧菌最適宜生長的pH值為8.8～9.2，結核分枝桿菌最適宜生長的pH值為6.5～6.8。
（3）培養基必須是的無菌的：所有培養基在制備結束時需要進行滅菌。不同的培養基滅菌的時間和溫度不同，既要保證滅菌效果，又要保證不損失培養基的必需營養成分。
（4）培養基的質量檢驗：培養基經滅菌後，必須要求置37℃溫箱中培養24小時無菌生長。同時將已知的標準參考菌株接種於相應的培養基上，經過37℃培養後細菌的生長繁殖狀況和生化反應與預期的結果相符。
（5）所用器皿須潔凈，忌用鐵或鋼質器皿。所用的化學試劑必須純凈，稱取的分量務必準確。
培養基制備的基本程式：稱量各種物質→溶解→測定及調整pH→濾過→分裝→滅菌後備用。
常用基礎培養基的制備。
（材料）
1.牛肉膏、氯化鈉、蛋白腖、蒸餾水、氫氧化鈉（1mol／L）、瓊脂。
2.高壓滅菌器、試管、天平、量筒、錐形瓶、pH計或試紙、平皿、電爐或微波爐、吸管、37℃培養箱、烤箱、超凈工作臺、酒精燈。
（方法）
1.肉湯培養基：稱取牛肉膏3g，蛋白腖10g，氯化鈉5g至錐形瓶，用量筒量取蒸餾水1000ml加入錐形瓶。攪拌或稍加熱使之完全溶解後，用1mol／L NaOH調整液體pH值至7.6。用吸管分裝至試管，加塞後置高壓滅菌器滅菌（121.3℃，20分鐘）。冷卻後取出。將肉湯置37℃細菌培養箱培養24小時，確定無細菌生長後（仍然為澄清透亮液體且管底無沉澱出現）方可應用。
2.固體培養基：在100ml pH值7.8的肉湯培養基中，加入2～3g瓊脂。加熱溶化，用紗布過濾，補足蒸餾水並分裝于試管和錐形瓶，試管加塞，二者同時置高壓滅菌器滅菌（121.3℃，20分鐘）。取出後趁熱斜置試管，冷凝後形成固體斜面培養基。錐形瓶取出後待培養基冷卻到50～60℃：時，在超凈工作臺中傾注於預先幹烤滅菌的玻璃平皿中（每皿20ml），蓋皿蓋並在試驗臺面上輕輕移搖，使液體狀態的培養基均勻鋪滿皿底。冷卻後即形成固體瓊脂平板培養基。將固體斜面和平板培養基置37℃細菌培養箱培養24小時，確定無細菌生長後方可應用。
瓊脂系石花菜中提取的半乳糖膠，對細菌並無營養作用。瓊脂具有特殊的物理性狀，在98℃以上時會由固體溶化成為液體，一旦成為液體，需要在45℃以下才能夠凝固。瓊脂是制備細菌培養基理想和常用的固化賦形劑。瓊脂多呈弱酸性，加入後使液體pH略下降，故一般採用pH值
7.8的肉湯培養基制備固體培養基。
3.半固體培養基：在100ml pH值7.8的肉湯培養基中，加入0.3～0.5g瓊脂。加熱溶化，用紗布過濾，補足蒸餾水並分裝于試管，每管約2～3ml，加塞包紮後置高壓滅菌器滅菌（121.3℃，20分鐘）。取出並冷凝後形成半固體培養基。將半固體培養基置37℃細菌培養箱培養24小時，確定無細菌生長後方可應用。
（保存）每批培養基作好制備記錄並注明標簽後，存放於陰涼暗處，最好置於普通冰箱冷藏保存。放置時間不宜超過1周。
二、細菌的接種技術及培養物的觀察
（一）固體平板培養基接種法
固體平板培養基主要用於分離混雜的細菌標本，以獲得細菌純種。該法是通過在瓊脂平板表面分區畫線，使細菌分散生長形成單個菌落，有利於分離出目的菌。
（儀器和材料）
1.菌種：大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌培養18～24小時肉湯培養物混合菌液。
2.培養基：普通瓊脂平板。
3.其他：接種環、酒精燈、恒溫培養箱、生物安全櫃、記號筆。
（方法）
1.開啟生物安全櫃。右手持接種環在火焰上燒灼滅菌，待冷，取菌種混合菌液一環。
2.將瓊脂平板倒放於桌面，左手持平板底部（皿蓋留在桌上），使瓊脂面盡量垂直，以減少空氣中雜菌落人，並靠近火焰附近操作。
3.右手握持蘸菌的接種環塗布於平板表面上端，用接種環來回畫線，密密塗布（約占整個平板面的1／10），形成1區。畫線時接種環與瓊脂表面約呈30°～40°輕輕接觸，用指力輕快地滑移，不可用力太大，以免劃破瓊脂。