現代液相色譜技術導論(第3版‧翻譯版)（簡體書）

作者：（美國）施耐德（Lloyd R.Snyder） （美國）Joseph J.Kirkland （美國）John W.Dolan 譯者：陳小明 唐雅妍

《現代液相色譜技術導論(第3版)》旨在滿足不同讀者的需求，無論你是初學者還是專家，《現代液相色譜技術導論(第3版)》的第3版都為你提供了最新、最全面以及通俗易懂的HPLC方法及其應用方面的知識。

第一章簡介
1.1背景信息
1.1.1什么是HPLC？
1.1.2 HPLC能用作什么？
1.2HPLC的歷史簡介
1.3HPLC的一些替代技術
1.3.1氣相色譜法（GC）
1.3.2薄層色譜法（TLC）
1.3.3超臨界流體色譜法（SFC）
1.3.4毛細管電泳法（CE）
1.3.5逆流色譜法
1.3.6 HPLC的特殊形式
1.4HPLC的其他信息資料
1.4.1書籍
1.4.2期刊
1.4.3綜述
1.4.4短期課程
1.4.5互聯網
第二章基礎概念和色譜分離的控制
2.1介紹
2.2色譜分析的過程
2.3保留
2.3.1保留因子k和色譜柱的死時間t0
2.3.2分離條件和樣品組成的角色
2.4峰寬和柱塔板數N
2.4.1N對色譜條件的依賴性
2.4.2峰形
2.5分離度和方法建立
2.5.1優化保留因子k（等式2—24中的a項）
2.5.2優化選擇性a（等式2—24中的b項）
2.5.3優化色譜柱的塔板數N（等式2—24中的c項）
2.5.4方法建立
2.6進樣量大小的影響
2.6.1體積超載：樣品體積對分離效果的影響
2.6.2質量超載：樣品重量對分離效果的影響
2.6.3避免進樣過多所引起的問題
2.7其他相關的問題
2.7.1色譜柱平衡
2.7.2梯度洗脫
2.7.3峰容量和二維分離
2.7.4峰跟蹤
2.7.5二次平衡
2.7.6色譜柱切換
2.7.7基于溶質的結構預測保留時間
第三章設備
3.1介紹
3.2儲液瓶和溶劑的過濾
3.2.1儲液瓶的設計和使用
3.2.2流動相的過濾
3.3流動相的脫氣
3.3.1脫氣的要求
3.3.2氦氣噴洗
3.3.3真空和管內脫氣
3.4管線和接頭
3.4.1管線
3.4.2接頭
3.5泵系統
3.5.1往復活塞泵
3.5.2在線混合
3.5.3梯度系統
3.5.4特殊應用
3.6自動進樣器
3.6.1六通口進樣閥
3.6.2自動進樣器的設計
3.6.3進樣量大小的影響
3.6.4閥門的其他應用
3.7色譜柱恒溫箱
3.7.1溫度控制的要求
3.7.2恒溫箱的設計
3.8數據系統
3.8.1實驗的輔助
3.8.2系統控制
3.8.3數據采集
3.8.4數據處理
3.8.5報告生成
3.8.6監管的功能
3.9柱外效應
3.10設備維護
3.10.1系統性能測試
3.10.2預防性維護
3.10.3維修
第四章檢測器
4.1介紹
4.2檢測器的特征
4.2.1一般設計
4.2.2檢測技術
4.2.3信號、噪聲、漂移和分析精確度
4.2.4檢測限
4.2.5線性
4.3各類檢測器的介紹
4.4UV—可見光檢測器
4.4.1固定波長檢測器
4.4.2可變波長檢測器
4.4.3二極管陣列檢測器
4.4.4一般UV檢測器的特征
4.5熒光檢測器
4.6電化學（安培）檢測器
4.7放射性檢測器
4.8電導檢測器
4.9氮化學發光檢測器
4.10手性檢測器
4.11示差折光檢測器
4.12光散射檢測器
4.12.1蒸發光散射檢測器（ELSD）
4.12.2凝結核光散射檢測器（CNLSD）
4.12.3激光光散射檢測器（LLSD）
4.13電暈放電檢測器（CAD）
4.14質譜檢測器（MS）
4.14.1接口
4.14.2四極桿和離子阱
4.14.3其他質譜檢測器
4.15其他的聯用檢測器
4.15.1（傅里葉變換）紅外光譜儀（FTIR）
4.15.2核磁共振（NMlK）
4.16樣品衍生化和反應檢測器
第五章色譜柱
5.1介紹
5.2色譜柱載體
5.2.1顆粒特征
5.2.2硅膠載體
5.2.3多孔聚合物
5.2.4整體柱
5.2.5其他無機顆粒
5.3固定相
5.3.1“鍵合”固定相
5.3.2其他基于有機物的固定相
5.3.3柱子的功能性（配合基種類）
5.4色譜柱的選擇性
5.4.1反相柱（RPC）選擇性的基礎
5.4.2柱子重現性和“等同的”柱子
5.4.3正交分離
5.4.4柱子選擇性的其他應用
5.5色譜柱的硬件
5.5.1柱子接頭
5.5.2柱子配置
5.6色譜柱的填充方法
5.6.1干填充法
5.6.2硬顆粒的勻漿填充法
5.6.3軟凝膠
5.7柱子的規格
5.7.1生產標準
5.7.2柱子塔板數
5.8色譜柱的處理
第六章中性樣品的反相色譜法
6.1介紹
反相色譜法的簡單歷史回顧
6.2保留
6.2.1溶劑強度
6.2.2反相色譜的保留過程
6.3選擇性
6.3.1溶劑強度選擇性
6.3.2溶劑類型選擇性
6.3.3溫度選擇性
6.3.4色譜柱的選擇性
6.3.5異構體分離
6.3.6其他的選擇性考量
6.4方法建立和優化選擇性的策略
6.4.1多變量優化
6.4.2優化色譜柱的條件
6.5非水性反相色譜法
6.6特殊問題
6.6.1極性很強的樣品保留較弱
6.6.2色譜峰拖尾
第七章離子樣品：反相、離子對和離子交換色譜法
7.1介紹
7.2酸堿平衡和反相保留
7.2.1緩沖液的選擇
7.2.2pK與化合物結構的函數關系
7.2.3有機溶劑和溫度對流動相pH和樣品pK值的影響
7.3反相色譜（RPC）對離子化合物的分離
7.3.1調控保留時間
7.3.2控制選擇性
7.3.3方法的建立
7.3.4特殊的問題
7.4離子對色譜法（IPC）
7.4.1保留的基本原理
7.4.2方法建立
7.4.3特殊問題
7.5離子交換色譜法（IEC）
7.5.1保留的基本原理
7.5.2反離子的角色
7.5.3流動相的pH
7.5.4IEC柱
7.5.5其他條件的角色
7.5.6方法建立
7.5.7碳水化合物的分離
7.5.8混合模式的分離
第八章正相色譜
8.1簡介
8.2正相色譜的保留行為
8.2.1理論
8.2.2 8溶劑和％B對溶劑強度的影響
8.2.3以TLC的數據預測NPC的保留 行為
8.3選擇性
8.3.1溶劑強度的選擇性
8.3.2溶劑類型的選擇性
8.3.3溫度的選擇性
8.3.4色譜柱的選擇性
8.3.5異構體的分離
8.4方法建立的總結
8.4.1NPC方法建立的初始條件：流動相強度和色譜柱類型的選擇
8.4.2選擇性優化的策略
8.4.3NPC方法建立示例
8.5NPC應用的常見問題
8.5.1重現性不佳
8.5.2溶劑分層和平衡時間過長
8.5.3色譜峰拖尾
8.6親水作用色譜法
8.6.1保留機制
8.6.2色譜柱
8.6.3親水作用色譜方法建立
8.6.4親水作用色譜的常見問題
第九章梯度洗脫
9.1引言
9.1.1使用梯度洗脫的其他原因
9.1.2梯度的形狀
9.1.3等度洗脫和梯度洗脫的相似之處
9.2實驗條件及它們對分離的影響
9.2.1 色譜柱條件改變的影響
9.2.2梯度洗脫條件改變的影響
9.2.3“非常規”的樣品
9.2.4定量測定的關系
9.3方法建立
9.3.1起始的梯度分離
9.3.2優化k*
9.3.3優化梯度選擇性a*
9.3.4優化梯度范圍
9.3.5分段（非線性）洗脫
9.3.6優化色譜柱的塔板數N*
9.3.7測量色譜柱的必要平衡時間
9.3.8方法的重現性
9.3.9色譜峰容量和快速分離
9.3.10全面的二維HPLC
9.4大分子的分離
9.5其他分離模式
9.5.1理論
9.5.2正相色譜法（NPC）
9.5.3親水作用色譜法（HILIC）
9.5.4離子交換色譜法（IEC）
9.6問題
9.6.1溶劑混合
9.6.2鬼峰
9.6.3基線漂移
第十章計算機輔助的方法開發
10.1介紹
10.1.1計算機模擬的基礎和歷史
10.1.2什么時候使用計算機模擬
10.2計算機模擬軟件
10.2.1DryLab操作
10.2.2梯度優化
10.2.3其他特點
10.2.4色譜峰跟蹤
10.2.5計算機模擬軟件的來源
10.3其他方法建立的軟件
10.3.1溶質保留和分子結構
10.3.2溶質pK值與分子結構
10.3.3反相色譜柱的選擇
10.3.4用于方法建立的專家系統
10.4計算機模擬與方法建立
10.4.1舉例1：藥物混合物的分離
10.4.2舉例2：方法建立的不同策略
10.4.3驗證方法的耐受性
10.4.4總結
第十一章定性與定量分析
11.1介紹
11.2信號測量
11.2.1積分操作
11.2.2保留
11.2.3峰的大小
11.2.4誤差的來源
11.2.5檢測限
11.3定性分析
11.3.1保留時間
11.3.2在線定性分析
11.4定量分析
11.4.1校正
11.4.2痕量分析
11.5總結
第十二章方法驗證
12.1前言
12.2術語及定義
12.2.1準確度
12.2.2精確度
12.2.3專屬性
12.2.4檢測限及定量限
12.2.5線性及范圍
12.2.6耐受性
12.3系統適應性
12.4文件
12.4.1確證草案
12.4.2檢測方法
12.4.3確證報告
12.5不同藥品分析方法的確證
12.5.1第一類方法
12.5.2第二類方法
12.5.3第三類方法
12.5.4第四類方法
12.6生物分析方法
12.6.1參考標準物的制備
12.6.2生物分析法的建立與確證
12.6.3生物分析法常規應用
12.6.4生物分析法文件
12.7分析方法的移交（AMT）
12.7.1分析方法移交選項
12.7.2AMT精要
12.7.3AMT潛在缺陷
12.8方法調整或方法修正
12.8.1pH的調試
12.8.2緩沖鹽溶液的濃度
12.8.3流動相組成成分的比例
12.8.4紫外可見光檢測器的波長
12.8.5溫度的調節
12.8.6柱長、直徑和顆粒大小的調整
12.9質量控制和質量保證
12.9.1質量控制
12.9.2質量保證
12.10總結
第十三章生物化學與合成聚合物的分離
13.1生物大分子
13.2分子的結構與構象
13.2.1肽類和蛋白質（多肽）
13.2.2核酸
13.2.3碳水化合物
13.2.4病毒
13.3生物分子高效液相色譜的特殊考慮
13.3.1色譜柱的特性
13.3.2蛋白質結構對色譜行為的影響
13.4肽類和蛋白質的分離
13.4.1反相色譜法（RPC）
13.4.2離子交換色譜（IEC）和相關技術
13.4.3疏水性相互作用色譜（HIC）
13.4.4親水作用色譜（HILIC）
13.4.5多維液相色譜（MDLC）在蛋白質組學上的應用
13.5核苷酸分離
13.5.1陰離子交換色譜
13.5.2反相色譜
13.5.3疏水作用色譜分析法
13.6分離碳水化合物
13.6.1親水作用色譜
13.6.2離子對分配色譜
13.6.3高效陰離子交換色譜
13.7病毒的分離
13.8尺寸排阻色譜法（SEC）
13.8.1尺寸排阻色譜法的保留過程
13.8.2凝膠過濾色譜柱
13.8.3凝膠過濾的流動相
13.8.4操作的考慮因素
13.8.5SEC的優點和局限性
13.8.6SEC的應用
13.9生物大分子的大規模純化
13.9.1背景
13.9.2重組人胰島素的生產規模的純化
13.9.3制備液相色譜分離蛋白質的一般要求
13.10合成聚合物
13.10.1背景
13.10.2聚合物的分析技術
13.10.3聚合物分析的液相色譜模式
13.10.4二維色譜分離聚合物
第十四章對映異構體的分離
14.1引言
14.2背景和定義
14.2.1異構和手性
……
第十五章制備色譜
第十六章樣品的制備
第十七章故障排除
附錄
附錄Ⅱ

最后，以整體柱（monolith）代替填充床柱（參閱本書5.2.4章節）是另外一個辦法。整體柱由一個連續的穿孔（through—pore）互聯骨架組成；流動相和溶質能夠借助這些穿孔流過柱子。因此，整體柱能在較低的壓力下進行高流速的操作，而其柱效僅會輕微降低。基于聚合物和硅膠的整體柱在市場上均有售。聚合物整體柱以聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯二乙烯苯的材料制成，在市場上它們以色譜柱和盤的形式出售，分別用于分析和制備色譜。這些材料都包含大孔和小孔的雙模態孔結構。
13.3.1.3支撐物的特性和穩定性
多孔硅膠的多種性質有助于它用作色譜柱的支撐物（參閱本書5.2.2章節）。令人遺憾的是，硅膠的其他性質卻限制了它在生物分子分離中的應用。用RPC分離肽類通常在酸性的條件（pH<3）下進行，而用離子交換分離肽類則通常在中性或堿性的條件（ph>7）下進行；有些基于硅膠的色譜柱在2.5≤pH≤7.5的范圍以外穩定性下降（參閱本書5.3.1、5.3.2.1章節）。色譜分離有時候需要在高溫下進行以改善峰形或者優化選擇性，但是鍵合相硅膠在高于40qC時穩定性會降低，特別是同時在極端的pH條件下。然而，使用合適的色譜柱和其他條件能降低流動相pH和溫度對色譜柱穩定性造成的不良影響。
另一個使用基于硅膠的色譜柱分離生物分子的主要潛在問題是：由于硅膠表面和溶質之間的強烈相互作用，使得生成的色譜峰很寬而且拖尾，以及由于不可逆的吸附造成樣品損失。這些問題對于老式的“A類”色譜柱尤為突出；因此強烈推薦選用高純度的“8類”色譜柱（參閱本書5.2.2.2章節）。峰端的反相高效液相色譜柱（end.cappedRPC columns）（參閱本書5.3.1章節）也能明顯降低樣品與色譜柱之間的不良相互作用。
人們尋求了許多方法來提高鍵合相硅膠的性能以便用于生物聚合物的色譜分析。現在，基于硅膠的反相高效液相色譜柱已成為分離大部分肽類的選擇。對于其他的色譜模式（如離子交換和疏水性相互作用），由于基于硅膠的填料的局限性，現在主要是用基于聚合物的柱填料來分離肽類（參閱本書5.2.3章節）。聚合物，如聚苯乙烯—二乙烯苯和聚甲基丙烯酸，能制成多孔顆粒直接用于色譜分析（如高聚物型苯乙烯—二乙烯基苯（PS.DVB）用于RPC）。或者，聚合物柱能通過引入特定的基團而具有不同的功能（如離子部分用于離子交換法，參閱本書7.5.4章節），這些填料在較廣的pH范圍內穩定（包括pH<2，ph>10）；也能在高溫下使用，而基于硅膠的色譜柱在高溫下則會受到破壞。它們在壓力為27.2～34MPa下也能保持穩定。用于制備和生產規模用途的聚合物材料的主要優勢是它能使用強堿清洗，這樣就能清除如內毒素之類的污染物。內毒素（一般為用于生物藥劑生產的宿主細胞內的脂多糖）會引起炎癥反應，因此必須避免內毒素進入人類使用的藥物中。
13.3.1.4質量回收率和生物活性
若以高效液相色譜（HPLC）分離的物質還需要進行進一步鑒定或有其他用途時，則要求分析物必須有好的回收率。如果要保留生物活性，則生物聚合物必須保持其天然構象。這就需要謹慎地選擇色譜模式和分離條件才能滿足這些要求。RPC可能會使蛋白質變性，因此通常不能用于回收分子量大的蛋白質。但是，經過RPC分離所得的變性后的肽類或者小蛋白質，暴露到離子條件合適且不含有機溶劑的緩沖液中，通常能恢復所有生物活性。選用其他洗脫條件苛刻（極端pH、高溫）的色譜模式都會損害到回收物的完整性和活性。多肽由于其活性部位吸附在柱填料上或截留在孔隙內，使得其質量回收率降低。用生物聚合物的替代物（如牛血清白蛋白或類似蛋白質性質的樣品）對柱子進行預處理，使柱子在使用前失活，有助于把吸附造成的樣品損失降到最低。由于在孔隙內蛋白質發生解折疊而造成的樣品損失，可以通過使用大孔徑的支撐物或緩和失活條件使損失降到最低。