分子生物學實驗教程（簡體書）
商品資訊
系列名：21世紀高等院校示範性實驗系列教材
ISBN13：9787562258919
出版社：華中師範大學出版社
作者：任峰; 李學寶
出版日：2013/01/22
裝訂／頁數：平裝／178頁
規格：23.5cm*16.8cm (高/寬)
版次：1
商品簡介
《21世紀高等院校示范性實驗系列教材：分子生物學實驗教程》可作為綜合性大學及理工和師范類院校生物學科各專業本科生與研究生的實驗指導，還可作為從事相關領域教學、科研工作人員的參考書。
名人/編輯推薦
《21世紀高等院校示范性實驗系列教材:分子生物學實驗教程》是21世紀高等院校示范性實驗系列教材，內容包括基因克隆鑒定、蛋白質表達與純化、轉基因技術、分子雜交技術、蛋白質—DNA相互作用分析等。
目次
實驗1 植物基因組DNA的分離與純化
實驗2 擬南芥總RNA的提取與純化
實驗3 逆轉錄cDNA的合成
實驗4 PCR克隆目的基因
實驗5 PCR：物的瓊脂糖凝膠電泳分析
實驗6 目的DNA的回收與純化
實驗7 目的基因與克隆載體的連接
實驗8 大腸桿菌感受態細胞的制備
實驗9 大腸桿菌的轉化
實驗10 陽性克隆的篩選與鑒定
實驗11 重組質粒的提取
實驗12 重組質粒酶切分析
第二篇 蛋白質表達與純化
第一篇 基因克隆鑒定
實驗1 植物基因組DNA的分離與純化
實驗2 擬南芥總RNA的提取與純化
實驗3 逆轉錄cDNA的合成
實驗4 PCR克隆目的基因
實驗5 PCR：物的瓊脂糖凝膠電泳分析
實驗6 目的DNA的回收與純化
實驗7 目的基因與克隆載體的連接
實驗8 大腸桿菌感受態細胞的制備
實驗9 大腸桿菌的轉化
實驗10 陽性克隆的篩選與鑒定
實驗11 重組質粒的提取
實驗12 重組質粒酶切分析
第二篇 蛋白質表達與純化
實驗13 大腸桿菌原核表達載體的設計與構建
實驗14 重組蛋白誘導表達與SDS—P．AGE檢測
實驗15 重組蛋白的分離與純化
第三篇 轉基因技術
實驗16 煙草葉盤法遺傳轉化
實驗17 擬南芥浸花法遺傳轉化
實驗18 轉基因斑馬魚的構建
第四篇 分子雜交技術
實驗19 Southern雜交分析
實驗20 Northem雜交分析
實驗21 Western Blot印跡技術
第五篇 蛋白質-DNA相互作用分析
實驗22 凝膠遷移實驗（EMSA）
實驗23 酵母單雜交技術
實驗24 雜色質免疫共沉淀（CHIP）
第六篇 蛋白質一蛋白質相互作用分析
實驗25 酵母雙雜交技術
實驗26 免疫共沉淀分析
實驗27 GST pull-down技術
實驗28 雙分子熒光互補技術
附錄 實驗報告
實驗1 植物基因組DNA的分離與純化實驗報告
實驗2 擬南芥總RNA的提取與純化實驗報告
實驗3 逆轉錄cDNA的合成實驗報告
實驗4 PCR克隆目的基因實驗報告
實驗5 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析實驗報告
實驗6 目的DNA的回收與純化實驗報告
實驗7 目的基因與克隆載體的連接實驗報告
實驗8 大腸桿菌感受態細胞的制備實驗報告
實驗9 大腸桿菌的轉化實驗報告
實驗10 陽性克隆的篩選與鑒定實驗報告
實驗11 重組質粒的提取實驗報告
實驗12 重組質粒酶切分析實驗報告
實驗13 大腸桿菌原核表達載體設計與構建實驗報告
實驗14 重組蛋白誘導表達與SDS—PAGE檢測實驗報告
實驗15 重組蛋白的分離與純化實驗報告
實驗16 煙草葉盤法遺傳轉化實驗報告
實驗17 擬南芥浸花法遺傳轉化實驗報告
實驗18 轉基因斑馬魚的構建實驗報告
實驗19 Southern雜交分析實驗報告
實驗20 Northern雜交分析實驗報告
實驗21 Western Blot印跡技術實驗報告
實驗22 凝膠遷移實驗（EMSA）實驗報告
實驗23 酵母單雜交技術實驗報告
實驗24 染色質免疫共沉淀（ChIP）實驗報告
實驗25 酵母雙雜交技術實驗報告
實驗26 免疫共沉淀分析實驗報告
實驗27 GST pull-down技術實驗報告
實驗28 雙分子熒光互補技術實驗報告
書摘/試閱
實驗14重組蛋白誘導表達與SDS—PAGE檢測
1.原理概述
（1）外源基因的誘導表達。
在大腸桿菌重組蛋白誘導表達中，外源基因構建在可控的強啟動子的下游，利用化學誘導物對啟動子的轉錄活性進行嚴格控制。在大腸桿菌表達載體上，目前常用的啟動子主要有lac啟動子、trp啟動子、T7啟動子等。這里僅介紹Novagen公司的pET系列載體的T7啟動子。在pET系列載體的T7啟動子之后引入了乳糖操縱子，使之受到lacI基因產物的控制。T7啟動子是來源于λ噬菌體的強啟動子，受到T7 RNA聚合酶的高度專一性識別。T7 RNA聚合酶具有很強的轉錄活性，合成mRNA的速率比大腸桿菌自身的RNA聚合酶高5倍，可以使外源基因的轉錄水平遠高于宿主自身基因，并使大部分的宿主細胞資源都用于目的蛋白的表達，通常情況下只需要幾個小時就可以使目的蛋白的表達量占宿主總蛋白的50％。
由于大腸桿菌自身不能產生T7 RNA聚合酶，所以需要將外源的T7 RNA聚合酶基因引入到大腸桿菌中。引進的方式就是使大腸桿菌BL21菌株成為噬菌體DE3的溶源化菌株，即形成BL21（DE3）菌株。噬菌體DE3攜帶有T7 RNA聚合酶基因和阻遏蛋白基因lacl，而且T7 RNA聚合酶基因受到lacUV5啟動子的控制，lacUV5啟動子受到乳糖或者IPTG的誘導。因此，將pET系列的表達載體導入大腸桿菌BL21（DE3）菌株后，用乳糖或者IPTG誘導就能實現外源基因的高效表達。
表達載體進入宿主細胞后外源基因的表達會消耗宿主細胞的能量和資源，從而影響宿主細胞生命活動和繁殖，這反過來又將影響重組蛋白的產量。因此，在大腸桿菌細胞中表達重組蛋白，一般采用兩階段培養方式。
第一個階段，不施加重組蛋白表達的誘導劑，不讓外源基因表達，旨在大量繁殖宿主細胞，為提高重組蛋白的表達量奠定基礎。一般從新鮮的劃線平板中挑取單克隆，接入10 mL～20 mL含有合適抗生素的LB培養基中，當細菌繁殖后再轉接人較大體積的LB培養基中。為獲得良好的通氣，培養基體積最多只能是搖瓶體積的20％，然后在合適的溫度下振搖培養至A600值達到0.5左右。
第二個階段，在宿主細胞大量增殖的基礎上加人誘導劑誘導外源基因的轉錄，可在較短時間內翻譯和積累大量的重組蛋白。在pET系統中，在生長培養基中加入終濃度為0.4 mmol·L—1的IPTG就可以實現完全誘導，而帶有T7 lac啟動子的載體則需要終濃度為1 mmol·L—1的IPTG才能完全誘導。在一些DE3宿主菌中通過調節IPTG的濃度可以改變蛋白表達的水平。在實際實驗中，可以嘗試添加不同濃度的IPTG并分析重組蛋白誘導表達的效果，從而獲得重組蛋白最佳誘導效果的IPTG濃度。
