微生物遺傳學實驗教程（簡體書）

第一章 微生物遺傳學基本操作技術



本章針對微生物基因重組的 3種方式：轉化、轉導和接合，以革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌（芽胞桿菌、放線菌）、真菌（絲狀真菌、酵母菌）和古菌為實驗材料，介紹了不同微生物遺傳操作體系。

實驗一 CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞及質粒轉化

一、實驗目的

1. 理解并掌握 CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞的原理和方法。



2. 學習并掌握轉化質粒 DNA的原理和方法。





二、實驗原理

在基因克隆技術中，轉化即細胞通過攝取外源遺傳物質（ DNA或 RNA）而發生遺傳學改變的過程，是一種常用的基本實驗技術。

研究發現，凡是能發生轉化的細菌，其受體細胞必須處于感受態。感受態是指受體細胞昀易接受外源 DNA片段，并能實現轉化的一種生理狀態。在自然條件下，只有少數細菌，如肺炎鏈球菌、芽胞桿菌、流感嗜血桿菌等能發生轉化作用，其他大多數細菌（包括大腸桿菌）是不發生自然轉化的。1970年，Mandel和 Higa首次證明受冰冷氯化鈣及短暫加熱處理后的細菌能被 λ噬菌體轉染。1972年，Cohen及其同事用同樣的方法成功地用質粒對細菌進行了轉化，進而使轉化成為異源 DNA在細胞間轉移的重要手段。目前，實際工作中所指的轉化，主要包括質粒 DNA及以質粒為載體的體外重組體進入細菌細胞的過程。

大腸桿菌是基因工程操作中常用的受體菌，用作感受態細胞的細菌，需要是限制-修飾系統缺陷的突變株，即不含有限制性內切酶和甲基化的突變株，常用符號 R.M.表示，否則，轉化進入的 DNA分子將被降解。其感受態一般是通過在 0 ℃條件下采用 CaCl2處理細胞而形成。基本原理是：細菌處于 0 ℃的 CaCl2低滲溶液中，會膨脹成球形，細胞膜的通透性發生變化，轉化混合物中的質粒 DNA形成抗 DNase的羥基-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經 42℃短時間熱激處理，促進細胞吸收 DNA復合物，在豐富培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，在選擇培養基

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上便可獲得所需的轉化子。

三、實驗材料

1. 菌種和質粒

菌種大腸桿菌（ Escherichia coli）DH5α：endA1 hsdR17 [r.m.] supE44 thi-1 recA1 gyrA[NalR] relA1Δ[lacZYA-argF] U169 deoR [Φ80ΔlacZ M15]質粒 pUC19：克隆載體，Ampr

2. 培養基

LB培養基（1 L）：

胰蛋白胨 10 g

酵母粉 5 g

NaCl 10 g



pH 6.8～7.0，121℃滅菌 30 min。

3. 抗生素

培養轉化子的氨芐青霉素（ Amp）終濃度為 50 μg/mL，用水配制 50 mg/mL的貯備液，-20℃保存。

4. 溶液或試劑

CaCl2（0.1 mol/L）。

四、實驗步驟

（一）純化及活化菌種

1

）將受體菌株大腸桿菌（ E. coli）DH5α劃線接種于 LB瓊脂平板中，置 37 ℃培養 16～20 h。



2

）挑取一單菌落接種到 20 mL的 LB培養液中（20 mL/250mL三角瓶），37 ℃振蕩培養 2～3 h，當其 OD600為 0.4～0.5時（細胞數＜ 108個/mL），即細胞生長的對數期，立即取出冰浴 10～15 min。



（二）制備感受態細胞



1

）將冰浴后培養液轉移到 2個 10 mL預冷的離心管中， 4 ℃ 5000 r/min離心 10 min。



2

）棄上清（注意：可用加樣器將殘留液體盡量除去），每管各加 5 mL的 0.1 mol/L冰預冷的 CaCl2溶液懸浮細胞，置冰浴中 20 min。



3）于 4 ℃ 5000 r/min離心 10 min，棄上清（注意：可用加樣器將殘留液體盡量除去），回收菌體。分別向每管加入 1 mL的 0.1 mol/L冰預冷 CaCl2溶液，重懸細胞，放置于冰上，即制備成感受態細胞懸液。



4

）將此細胞懸液按每份 200 μL分裝于無菌離心管中，如果不馬上使用可加入終濃度為 10%的無菌甘油，置-20℃或-70℃冰箱長期保存。





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注意：①實驗所用的溶液昀好用 3次蒸餾的水配制，盡量在冰上操作；②冰浴為冰水混合物的效果較佳；③新制備的感受態細胞如果在 4 ℃放置 12～24 h，其轉化率可增高 4～6倍，但 24 h后，轉化率將下降；④以上均要求嚴格無菌操作。

（三）轉化感受態細胞

1）取 10 μL的 pUC19質粒 DNA加入到以上制備的 200 μL感受態細胞中（不超過 10 μL的體積，其中 DNA小于 50 ng）。



2

）將以上每管樣品輕輕混勻，置冰浴 30 min，然后置 42℃水浴熱激 90 s（熱激是關鍵步驟，準確達到熱激溫度非常重要），不要搖動管，迅速放入冰浴 2 min。



3

）向每管樣品中加入 800 μL LB培養基，置 37℃搖床， 100～150 r/min，振蕩保溫 45～60 min，即得轉化混合物。在上述步驟中，同時做一個只加細菌不加 DNA的樣品作陰性對照。



4

）將轉化混合物和未接觸質粒 DNA的對照細菌各 100 μL，分別涂于含氨芐青霉素（50 μg/mL）的 LB瓊脂平板上，室溫下放置 20 min。





5）待菌液被瓊脂吸收后，倒置平板于 37℃培養 12～16 h，觀察結果。

五、實驗結果

1. 自行設計表格記錄實驗結果。



2. 按照以下公式計算轉化效率。





轉化效率.轉化子總數

DNA 質粒加入量(μg)

六、問題與討論

1. 討論實驗中影響細菌質粒轉化的因素有哪些。



2. 本轉化實驗中，質粒的濃度是否越高越好？





七、參考文獻

黃秀梨，辛明秀. 2008. 微生物學實驗指導 . 2版. 北京：高等教育出版社.

沈萍，陳向東. 2007. 微生物學實驗 . 4版. 北京：高等教育出版社 .

楊蘇聲，周俊初. 2004. 微生物生物學 . 北京：科學出版社 .

周德慶. 2011. 微生物學教程. 3版. 北京：高等教育出版社.

Ausubel F M，Brent R，Kingston R E，et al. 2005. 精編分子生物學實驗指南 . 4版. 馬學軍，舒躍龍等譯. 北京：科學出版社 .

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實驗二 一步法制備和轉化大腸桿菌感受態細胞

一、實驗目的

1. 了解常用的轉化原理和方法。



2. 比較不同轉化方法的優缺點。



3. 掌握一步法制備和轉化大腸桿菌感受態細胞的方法。





二、實驗原理

細菌受體細胞的轉化方法是基于物理學和生物學原理建立起來的， 1983年， Hanahan設計了一套用二甲基亞砜（ DMSO）和二巰基蘇糖醇（ DTT）誘導細胞產生高頻感受態的程序，從而大大提高了大腸桿菌的轉化效率，獲得高達 5×108個轉化菌 /μg超螺旋質粒DNA的轉化效率。目前常見的轉化方法有 CaCl2轉化、聚乙二醇（ PEG）介導的原生質體轉化和電轉化等。一步法制備和轉化大腸桿菌感受態細胞是 1989年由Chung改進并報道的，以 PEG、DMSO和Mg2.為主要成分配制 TSS溶液，一步實現感受態細胞制備和轉化的方法。該方法中聚乙二醇為多糖類物質，可能有促使質粒 DNA與感受態細胞膜結合的作用，與 Mg2.及葡萄糖共同促進質粒轉化。

（一）轉化效率影響因素

轉化效率的高低受多種因素的影響，包括受體菌類型、細菌的生長狀態、 DNA分子的大小和濃度、試劑的純度、玻璃和塑料器皿的清潔度等。

1. 受體菌類型

一步法適用于很多分子克隆中常用的大腸桿菌，如MM294、DH5.、DH1、JM109、 LE392、XL-1、HB101、SCS-1和RR1等，但不同菌株的感受態效率略有差別，其中 MM294效率昀高，為（ 6.03±0.50）×107個轉化子/.g超螺旋質粒DNA，而RR1相對來說效率較低，為（ 0.49±0.03）×107個轉化子 /.g超螺旋質粒DNA，筆者在教學實踐中也嘗試使用 S17-1，獲得了高于 DH5.的轉化效率。

2. 細菌生長狀態

細菌生長狀態對轉化效率影響較大，由于未知的原因，直接取凍存于-70℃低溫冰箱中的菌株可以獲得更高的轉化效率。菌株在對數生長前期（OD600=0.35～0.55）及穩定期（OD600=0.9）可獲得昀高感受態效率，由于穩定期時間不易控制，通常選擇對數生長前期，超過這個時期，感受態效率將以數量級遞減。

3. DNA分子大小、純度和濃度

大于15 kb的質粒及純度較低的質粒 DNA均對轉化效率有影響。一步法中昀適

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DNA濃度為100 pg～1 ng，1 ng～1 μg濃度質粒DNA將降低轉化效率。當用連接產物做轉化時，相對于超螺旋質粒 DNA的轉化效率至少降低2個數量級，每微克連接產物 DNA所能獲得的真正轉化子取決于連接反應所產生的重組質粒的量，以及轉化反應中的抑制物，如酶等成分。

4. 試劑的純度

使用高純度的水、DMSO、PEG制備感受態細胞是昀重要的，例如， DMSO的氧化產物推測是二甲硫醚，是轉化的抑制物。包括細菌培養基成分在內的某些試劑會隨著貯存期的延長而降低功效，因此，盡可能使用新買的試劑和培養基。

5. 玻璃和塑料器皿的清潔度

微量的洗滌劑或其他化學物質會大幅度降低細胞轉化效率，因此，昀好建立一批專門用于制備感受態細胞的專用容器，并且使用前用超純水充滿后，高溫滅菌后再使用。

一步法制備和轉化感受態細菌能得到 CaCl2轉化方案中的轉化率（ 106～107），但操作更為簡便，不需熱激，并且冰浴時間要求不嚴格，在 5～60 min能獲得同樣的轉化效率，此外，制備的感受態細胞可以直接保存于-70℃低溫冰箱，在 180天內保持較好的轉化效率。因此，該方法可以滿足實驗室常規克隆的需求，操作步驟簡便，重復性好，有利于在實驗室中大規模推廣和應用。

（二）轉化子的鑒定

實際研究工作中，通常需要轉化的是重組質粒，對含有重組質粒菌株進行鑒定，除了需要抗性篩選外，常見的方法還有以下幾種。

1-互補

許多載體（如 pUC系列）都帶有大腸桿菌 β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼.-肽鏈的 DNA序列，在.-肽鏈的 DNA序列中包含著保持可讀框的多克隆位點，當這種載體與可編碼 β-半乳糖苷酶 C端部分序列的宿主細胞（如 DH5.和 JM109）共同存在時，便會產生有功能活性的 β-半乳糖苷酶分子，在生色底物 5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷（ X-gal）和誘導物異丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）存在下形成藍色菌落。若外源 DNA片段插入到質粒的多克隆位點后，會阻斷 .-肽鏈的合成，因此含有重組質粒的克隆是無色的，可以與含有非重組質粒的克隆所形成的藍色菌落明顯地區別開來。然后通過小量提取質粒進行限制性酶切分析，就可以確證質粒的結構。

2. 重組質粒快速鑒定（Cracking）

重組質粒中由于含有外源 DNA片段而比非重組質粒的分子質量大，因此，以 1×Cracking buffer（2×Cracking buffer：0.2 mol/L NaOH，0.5% SDS，0.05%溴酚藍， 20%蔗糖）裂解少量細菌細胞，直接電泳會發現白色重組質粒 DNA的遷移率比藍色菌落中的非重組質粒 DNA的遷移率慢，由此即可初步對重組質粒進行鑒定區分。

3. 菌落 PCR

以單菌落制備的菌懸液為 PCR擴增的模板，選擇重組質粒上合適的引物（可選

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擇多克隆位點兩側的引物，或利用目的基因序列設計引物），PCR擴增后，電泳檢測擴增條帶的大小是否正確，以鑒定重組質粒是否轉化成功。

4. 小規模制備質粒 DNA進行限制性酶切分析

限制性內切酶（ restriction endonuclease）能識別 DNA分子中的特異序列，并在此特異位點將雙鏈 DNA切斷。根據重組質粒酶切圖譜分析的結果，選擇合適的限制性內切酶對少量制備的質粒進行酶切，并電泳檢測其正確性，同時以空載體作為陰性對照。

5. 雜交篩選

以目的基因標記探針，通過 Southern印跡，確定是否有陽性信號，對重組質粒進行鑒定。

6. 報告基因的檢測

若重組質粒中外源整合基因片段為報告基因，也可以檢測報告基因的表達，直接確定其正確性。在實際工作中，前 4種方法比較簡便而通用。

本實驗中選擇的轉化質粒 pMP2444是在廣宿主載體 pBBR1MCS-5多克隆位點中整合了 gfp報告基因的重組質粒。gfp基因編碼綠色熒光蛋白，由于其光毒性弱，非常適合標記活細胞，且不需要底物誘導，廣泛應用于分子標記、藥物篩選、融合抗體、信號轉導等研究領域。

三、實驗材料

1. 菌種和質粒

菌種大腸桿菌（E. coli）S17-1：pro thi recA hsdR（RP4-2 Km：：Tn7 Tc：： Mu，整合在染色體中） Smr Sper

質粒 pMP2444（圖 2-1）：gfp，Gmr，來源于廣宿主范圍載體 pBBR1MCS-5



圖 2-1 pMP 2444質粒構建圖譜（Stuurman，2000）