臨床微生物學：細菌與黴菌學

本書為淺顯易懂的中文臨床微生物學入門必備書。其特色為：
•所採用臨床微生物圖片，均自行拍攝或由國內專家提供。
•書內相關章節的病例討論及參考文獻，大多引用國內學者的學術論文期刊，以期讓讀者能明瞭台灣現狀。

新版的臨床微生物學與時俱進，加入不少新資訊，不僅適合醫技系初學者，也適合醫學系學生、醫院醫檢師、感染科醫師、感控人員及相關醫護人員學習使用，相信在閱讀本書後，將能對臨床微生物學有概括的了解。

總校閱簡介
吳俊忠
現職：陽明交通大學醫學生物技術暨檢驗學系特聘教授
科技部「人體微生物相專案研究計畫」召集人
美國微生物學院院士
作者簡介（依姓氏筆劃排序）
吳雪霞
現職：台北醫學大學醫學檢驗暨生物技術學系副教授
周以正
現職：中華醫事科技大學醫事檢驗生物技術學系助理教授
周如文
現職：衛生福利部疾病管制署結核病防治研究中心研究員兼主任
陽明大學微生物及免疫研究所兼任教授
林美惠
現職：長庚大學醫學生物技術暨檢驗學系副教授
胡文熙
經歷：陽明大學醫學生物技術暨檢驗學系教授兼主任
洪貴香
經歷：成功大學醫技系博士後研究員
孫培倫
現職：林口長庚醫院皮膚科副教授
長庚大學醫學系副教授
ISHAM Asia Fungal Working Group委員
張長泉
經歷：成功大學醫學院醫學檢驗生物技術學系教授
張益銍
現職：亞洲大學醫學檢驗暨生物技術學系副教授
彭健芳
經歷：高雄醫學大學醫學技術學系系主任
湯雅芬
現職：高雄長庚紀念醫院感染管制課
曾嵩斌
現職：高雄醫學大學醫學檢驗生物技術學系教授兼系主任
楊宗穎
學歷：高雄醫學大學 醫學檢驗生物技術學系博士
楊翠青
現職：陽明交通大學醫學生物技術暨檢驗學系教授
廖淑貞
現職：臺灣大學醫學院醫學檢驗暨生物技術學系教授
褚佩瑜
現職：高雄醫學大學醫學檢驗生物技術學系教授
蔡佩珍
現職：成功大學醫學院醫學檢驗生物技術學系教授
成功大學醫學院附設醫院兼任醫檢師
蘇伯琦
現職：慈濟大學醫學檢驗生物技術學系教授
蘇玲慧
經歷：長庚醫院林口醫學中心醫檢教研部感控研究組長

第1章　臨床微生物總論（彭健芳）
第2章　疾　病（楊宗穎、曾嵩斌）
第3章　革蘭氏陽性球菌—葡萄球菌與相關細菌（林美惠）
第4章　革蘭氏陽性球菌—鏈球菌屬（楊翠青）
第5章　革蘭氏陽性球菌—腸球菌及其他觸酶陰性革蘭氏陽性球菌（蔡佩珍）
第6章　革蘭氏陰性球菌—奈瑟氏球菌屬和莫拉克氏球菌屬（張益銍）
第7章　革蘭氏陽性桿菌—棒狀桿菌屬（周以正）
第8章　革蘭氏陽性桿菌—李斯特菌和類丹毒桿菌屬（周以正）
第9章　革蘭氏陽性桿菌—桿菌屬（周以正）
第10章　革蘭氏陽性菌—分枝桿菌屬（周如文）
第11章　革蘭氏陽性桿菌—放線菌目（周以正）
第12章　革蘭氏陰性桿菌—腸桿菌科（蘇伯琦）
第13章　革蘭氏陰性桿菌—非發酵性桿菌（吳雪霞）
第14章　革蘭氏陰性桿菌—弧菌菌屬、產氣單胞菌菌屬、彎曲桿菌菌屬（張益銍）
第15章　革蘭氏陰性桿菌—挑剔菌∕其他少見菌（褚佩瑜）
第16章　厭氧性革蘭氏陽性細菌（廖淑貞）
第17章　厭氧性革蘭氏陰性細菌（廖淑貞）
第18章　密螺旋體屬、疏螺旋體屬、鉤端螺旋體屬（胡文熙）
第19章　黴漿菌屬、尿漿菌屬（胡文熙）
第20章　披衣菌科、立克次體科、貝氏考柯斯菌（胡文熙）
第21章　臨床真菌（孫培倫）
第22章　抗微生物製劑感受性試驗（洪貴香、吳俊忠）
第23章　臨床微生物分子診斷（張長泉）
第24章　醫療照護相關感染（蘇玲慧、湯雅芬）
附錄
索引
附圖

1-1　總論

一、細菌的構造（Bacterial Structure）
細菌的構造是原核細胞，除了細胞壁以外，原核細胞的內部構造都比真核細胞簡單。

細胞外膜（Cell Envelope）
大部分的細菌都有細胞外膜，它是由細胞壁以及細胞膜所組成。

細胞壁（Cell Wall）
菌體之表層有堅韌的細胞壁圍住細胞膜。細胞壁可保護菌體，抵抗外界物理性損害，例如：低滲透壓或低溫等。有些細菌之細胞壁外層有莢膜（capsule）或黏液層（slime）。細胞壁下層的細胞膜和其內容物統稱為原質體（protoplast），由此伸出菌體外之特殊構造有鞭毛（flagella）和線毛（pili）。鞭毛與細菌的運動有關，線毛則與細菌之附著以及行接合生殖有關。細胞質內尚有：類核體（nuclear body）、核糖體（ribosome）與包涵體（inclusion Body）等。有些細菌在細胞質內有內芽孢（endospore）。細菌之細胞壁位於細胞膜外。正常細菌除了黴漿菌（Mycoplasma）皆有細胞壁。
細胞壁主要功能是保持菌體形狀與其堅韌性，使菌體免於破裂。細菌由於細胞膜有主動運送（active transport）系統，例如：胺基酸糖及無機離子等，可從低濃度之環境透過細胞膜進入高濃度之細胞質。
細胞壁構造的主要成分是Peptidoglycan（murein, mucopeptide），由於Peptidoglycan的交互錯綜連接，造成細胞壁之堅韌。革蘭氏陽性細菌的細胞壁比革蘭氏陰性細菌細胞壁厚。因此革蘭氏陽性細菌要較革蘭氏陰性細菌能抵抗較高的內部滲透壓。細菌的Peptidoglycan是由N-Acetylglucosamine與N-Acetylmuramic Acid兩分子交替連接所組成的骨架。兩個鄰近的Peptidoglycan再經由D-alanine形成多胜鏈而成連接梁（crosslinking）。

細胞質膜（Cytoplasmic Membrane）
細胞質膜位在細胞壁下，作為菌體細胞內部與外部的屏障，由雙層磷脂質（phospholipidbilayer）以及其間的蛋白質所構成。細胞膜是半透膜，能將菌體所需之成分及巨分子物質留在菌體內，同時能自外界吸取營養物，以供體內之需。因此細胞膜具選擇性。同時細菌的主動運送系統（active transport）之進行，係在細胞膜之脂層自由流動。

革蘭氏陽性細菌與革蘭氏陰性細菌之差異

革蘭氏陽性細菌
革蘭氏陽性細菌之細胞壁幾乎全由厚且緊密的Peptidoglycan及Teichoic Acid所形成的聚合體組成。

革蘭氏陰性細菌
革蘭氏陰性細菌之細胞壁雖較革蘭氏陽性細菌為薄，但其化學組成則較為複雜。革蘭氏陰性細菌的細胞壁只有兩層的Peptidoglycan，沒有Teichoic Acid。革蘭氏陰性細菌另外有外膜（outer membrane）位於Peptidoglycan層之外，外膜比單層的Peptidoglycan厚。外膜有三種成分：脂質層（lipid bilayer），蛋白（protein）和脂多醣體（lipopolysaccharide）。

菌體外部構造（External Structure）
菌體外部構造重要的有莢膜（capsule）、鞭毛（flagella）和線毛（pili）。

莢膜（Capsule）
為一種無固定形狀的黏滑狀的膠狀膜，通常其化學組成為多醣（polysaccharide），但在Bacillus anthracis為多個D-Glutamate形成的多胜（polypeptide）。

鞭毛（Flagella）
鞭毛為完全由蛋白質構成的細線型構造。構成鞭毛的組成單位是由一鞭毛蛋白（flagellin）蛋白質。鞭毛是細菌的運動小器官。鞭毛的基體埋於細胞膜上與細胞膜或細胞壁連接，環（hook）與鐵絲（filament）（例如：L環［L-Ring］）連接細胞壁的脂多醣體層。

線毛（Pili, Fimbriae）
革蘭氏陰性的細菌在其表面有很堅韌的附屬物稱為線毛，由Pili蛋白所構成。線毛較鞭毛更為纖細而短。線毛有兩種，其中一般線毛（ordinary pili），有助細菌附著宿主細胞；另有一種線毛叫性線毛（sex pili），當細胞行接合生殖時，扮演相當重要的角色。

細菌的染色
觀察細菌，染色步驟是一個很重要的工具，可以幫助微生物學家對於所分離的菌種進行分類與鑑定。細菌的染色方法有很多種類，最常用的是革蘭氏染色（Gram Stain）。細菌可依據革蘭氏染色反應結果分為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性，這是細菌在鑑定過程中一個重要的特徵。抗酸性染色（Acid-fast staining）步驟則是應用於辨識分枝桿菌（Mycobacteria）是否存在痰液、支氣管沖洗液等。有許多特殊染色步驟使用於芽胞、鞭毛、細胞壁與核酸等染色，這些染色技術對於菌種分類上的應用較少，較常用於觀察菌體的特殊構造。

革蘭氏染色（Gram Stain）
1883年，革蘭氏（Christian Gram）發展了革蘭氏染色（Gram stain）。一直到今日，真正的生理化學反應在整個染色過程中仍有些不清楚。細胞壁的通透性是主要決定一個菌體細胞的革蘭氏染色反應結果。因為革蘭氏陽性菌的菌體細胞壁的生理化學差異性比革蘭氏陰性菌對於結晶紫—碘複合物（crystal violet-iodine complex）的滯留性較強而呈現紫黑色的菌體，不受95% 酒精的脫色作用。反之，革蘭氏陰性菌體因為結晶紫—碘複合物沒有滯留性，在95% 酒精作用下會將結晶紫流失，於對比染色時，因沙黃液（safranin O）的顏色而呈現紅色。同時，菌體細胞壁的化學組成的存在與否，會改變菌體的染色性，例如：Nucleoprotein、Ribonucleic acid、Polysaccharide從菌體萃取出來時，或者細胞壁受抗生素作用而抑制其合成等。革蘭氏染色除了觀察純培養的菌體外，更能應用於臨床檢體的直接鏡檢。可作為病原菌快速的初步檢定。例如：體液、不受汙染的膿瘍、軟組織的感染物、男性尿道分泌物等。病患尿液的直接鏡檢，可作為是否是感染症的依據。
臨床檢體的鏡檢，包括菌體的型態、數目及細胞的完整性。膿細胞的核會因為革蘭氏染色呈粉紅色。革蘭氏染色反應常受某些因素的影響而改變。菌體培養的時間在18∼24小時，其染色反應正常。但若培養的時間過久而使菌體老化，會改變菌體的染色性，尤其是革蘭氏陽性菌，會因而變成革蘭氏陰性的反應。抑制菌體細胞壁合成的抗生素，會造成革蘭氏陽性菌對脫色液的敏感性增加而脫色。
臨床檢體的顯微鏡檢查有下列三個目的：

中性球（neutrophils）的數目和比例可以顯示發炎反應的形式和輕重度。痰液的革蘭氏染色，可以判定痰液的品質。若麟狀上皮細胞的數目在低倍顯微鏡（100x）下觀察，小於10個，而中性球大於25個時，表示痰液的品質是細菌性感染，屬於有臨床意義的檢體。
立刻知道檢體的品質，檢體中所出現的細菌，菌絲、酵母菌等，可提供訊息，作為初步的實驗診斷，給予特殊治療。
直接鏡檢配合需氧菌培養可以觀察是否有厭氧菌的存在。

抗酸性染色（Acid-Fast Stain）
菌體的細胞壁含豐富的長鏈脂肪酸，使細菌對於Carbolfuchsin的染色不會被酸性酒精（3% HCl Alcohol）脫色。這些細菌（主要為Mycobacteria species）被稱為抗酸菌（acid-fast）。抗酸性染色的直接鏡檢，可以快速偵測結核病的病患，也可以作為藥物療效的評估。
傳統式抗酸性染色法為Ziehl-Neelsen法，需要加熱幫助染色劑滲透入菌體的蠟質之細胞壁。Kinyoun氏法又稱為冷染色法（cold-stain-method），因染色劑的濃度提高，或加入表面活性清潔劑（如Tergitol），而不必加熱，染色效果同Ziehl-Neelsen法。分枝桿菌的螢光染色（Fluorochome Stain for Mycobacteria），使用螢光劑（例如：Auramine和Rhodoamine）可顯示抗酸菌的存在。在螢光顯微鏡下觀察，菌體是呈現黃色菌體，背景則是Potassium Permanganate的對比染色。螢光染色下，在25倍的生物鏡下，可觀察到抗酸菌的存在。
因為抗酸菌有高度感染性，染色過程的操作最好在生物安全櫃內進行，包括抹片的製備是來自臨床檢體、混合菌株的標本和純種培養的菌體。抹片的製備可以直接來自臨床檢體，或者檢體經過消化去汙濃縮而來。抹片的製備，在玻片上讓其自然乾燥，在65℃的電器上放置2小時，可使菌體不活化，固定之。

美藍染色（Methylene Blue Stain）
美藍染色適用於觀察Haemophilus influenzae和Neisseria meningitidis的存在，因為這兩種菌屬使用革蘭氏染色所呈現革蘭氏陰性的紅色並不明顯。使用美藍染色，則多核白血球細胞染色成藍色，H. influenzae菌體則呈現深藍，背景則為灰色。

直接鏡檢方法（Direct Smear Examina-tion）

Potassium hydroxide直接鏡檢方法
Potassium hydroxide（KOH）載置法（KOH Mounting）使用10% KOH等量與皮屑、指甲、或毛髮混合蓋上玻片，於火焰上稍微加熱，放置室溫30分鐘後，鏡檢。用以觀察是否有黴菌菌絲體的存在。

India Ink鏡檢（India Ink Preparation）
使用等量的India Ink與CSF混合，然後蓋上玻片鏡檢。觀察Cryptococcus neoformans的存在與否。