蛋白質高效表達技術（簡體書）

《蛋白質高效表達技術》是從事生物化學、分子生物學、生物技術、生物醫藥等基礎和應用研究的科研人員必須涉及和面對的基本技術問題。《蛋白質高效表達技術》作為一本蛋白質高效表達的工具書，將常見的基因高效表達系統及其相關要點和經驗進行總結，具有以下內容特色：涵蓋了大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌、哺乳動物、轉基因動物、轉基因植物等主要基因表達系統；專門章節論述重組蛋白的分離純化和復性這一重要問題；內容較精要，匯集了蛋白質科學工作者的工作經驗，實用性較強。《蛋白質高效表達技術》可供分子生物學、發育生物學、蛋白質組學、藥學等領域的教學和研究人員參考閱讀。

《蛋白質高效表達技術》包括了大腸桿菌表達體系、重組蛋白的分離純化和復性、酵母表達系統、芽孢桿菌基因表達系統、哺乳動物細胞表達系統、轉基因動物表達系統、轉基因植物生物反應器等。

蛋白質高效表達是從事生物化學、分子生物學、生物技術、生物醫藥等基礎和應用研究的科研人員必須涉及和面對的基本技術問題。不同蛋白質之間由于其性質上的差異，使得不同蛋白質的表達水平和表達難題差異很大，蛋白質高效表達在實際研究工作中成為一個探索性強、個性差異大的研究階段。本實驗室長期從事多?藥物的基因工程和蛋白質工程研究，蛋白質高效表達技術是本實驗室常用的技術。本書是應化學工業出版社相關編輯的邀請而撰寫的，旨在撰寫一本蛋白質高效表達的工具書，將常見的基因高效表達系統及其相關要點和經驗進行總結，為從事基因工程的研究人員提供參考和便利，幫助初次進行蛋白質高效表達工作的研究人員縮短其摸索過程。
作者非常感謝化學工業出版社相關編輯的長期支持和鼓勵，沒有他們的鼓勵，本書的出版是不可能完成的。
本書各章編寫人員如下。第一章：曹林博士。第二章：馬定遠博士。第三章：方雷博士。第四章：李淑鋒博士。第五章：賈立軍博士、劉紅旗博士。第六章：徐寒梅博士。第七章：孫啟明博士、趙永娟碩士。李淑鋒博士參與了全書的校對和整理。
由于本書作者缺乏經驗，撰寫過程多有周折，書中不妥之處在所難免，懇望讀者批評、指正和諒解。
華子春
2011年9月

第一章 大腸桿菌表達體系1
第一節 原核表達載體2
一、pET載體4
二、pKK2233載體5
三、IMPACTTM系統載體和pMALTM系統載體5
四、pWIN表達系統5
五、pGEX系統5
第二節 原核表達宿主菌6
第三節 選擇構建載體的策略8
第四節 重組蛋白的溶解性8
第五節 增加蛋白質穩定性的策略9
一、宿主菌選擇10
二、分泌型表達10
三、包含體11
第六節 大腸桿菌表達體系的基本操作流程11
一、基因片段的制備11
二、載體制備12
三、載體?切消化反應和從凝膠進行載體的純化和回收12
四、制備插入片段13
五、將基因片段克隆到表達載體14
六、篩選陽性克隆、測序分析16
七、轉化表達宿主菌及誘導和優化目的蛋白表達16
八、培養放大及目的蛋白的純化17

第二章 重組蛋白的分離純化和復性18
第一節 概述18
第二節 分離純化的方法策略及其應用20
第三節 包含體蛋白質的折疊復性22
一、蛋白質折疊的過程和機理24
二、包含體的分離和溶解25
三、溶解後包含體蛋白質的折疊復性26
第四節 可溶重組分子的分離純化32
一、色譜技術在分離純化中的應用33
二、親和標簽在重組蛋白分離純化中的應用34
第五節 結語47

第三章 酵母表達系統48
第一節 幾種主要酵母表達系統49
一、釀酒酵母表達系統49
二、甲醇營養型酵母表達系統50
三、裂殖酵母表達系統52
四、乳酸克魯維亞酵母表達系統52
五、其他酵母表達系統52
第二節 酵母表達載體概況53
一、酵母載體的類型53
二、酵母載體的基本結構54
第三節 酵母表達系統的研究方向55
一、提高外源蛋白在酵母中的表達水平55
二、提高外源基因表達產物的質量55
第四節 酵母表達系統的應用和展望56

第四章 芽孢桿菌基因表達系統57
第一節 芽孢桿菌基因表達系統的特點57
第二節 芽孢桿菌表達載體58
一、自主復制質粒58
二、整合質粒58
三、噬菌體59
四、轉化方法59
第三節 宿主菌59
第四節 外源基因在芽孢桿菌中的分泌表達59
第五節 芽孢桿菌高效表達外源基因的策略及發展方向60
一、降低芽孢桿菌胞外蛋白?活性60
二、提高表達質粒在細胞中的穩定性60
三、擴大芽孢桿菌宿主/載體表達系統61

第五章 哺乳動物細胞表達系統62
第一節 哺乳動物細胞表達載體65
一、表達載體基本種類與組成元件65
二、篩選標記基因66
第二節 常見的生產用細胞表達系統70
一、CHO表達系統70
二、鼠骨髓瘤細胞系70
三、COS細胞71
四、Vero細胞71
第三節 大規模哺乳動物細胞培養的新趨勢71
一、抑制細胞凋亡71
二、可誘導表達73
三、新的生產工藝73

第六章 轉基因動物表達系統74
第一節 制作轉基因動物常用方法74
第二節 同源重組介導的基因打靶76
第三節 組織特異性表達——乳腺表達的調控元件80
一、乳汁酪蛋白81
二、乳清酸蛋白82
三、β乳球蛋白基因83
第四節 顯微注射法制備轉基因小鼠技術85
一、注射DNA的純化和定量85
二、轉基因實驗用鼠的種類85
三、超數排卵、受精卵收集和培養86
四、顯微注射86
五、胚胎移植87
六、檢測87
第五節 問題與展望89

第七章 轉基因植物生物反應器91
第一節 引言91
第二節 轉基因植物的原理與方法93
一、概述93
二、轉基因植物的選擇93
三、農桿菌介導的轉基因技術94
四、病毒載體介導的轉基因技術100
五、直接轉化法獲得轉基因植物102
第三節 適于重組蛋白表達的植物宿主105
一、煙草105
二、谷類和豆類作物105
三、水果和蔬菜106
第四節 轉基因植物表達重組蛋白研究進展107
一、轉基因植物可食疫苗研究107
二、轉基因植物抗體工程114
第五節 葉綠體轉基因工程117
一、葉綠體基因組的特征117
二、葉綠體轉化系統的優越性118
三、外源基因導入葉綠體的方法119
四、葉綠體中表達外源基因的研究進展120
五、存在問題與解決策略120
六、葉綠體遺傳轉化的前景和展望122
第六節 轉基因植物安全標記基因的使用及抗性基因的剔除122
一、轉基因植物使用的安全標記基因123
二、轉基因植物中抗性基因的剔除126
三、展望130
第七節 理性認識轉基因植物的安全問題130
一、轉基因植物食品的安全問題130
二、轉基因植物的生態安全問題132
參考文獻135

在凝膠過濾復性中，發展了一種梯度復性的方法，這一方法的原理基于復性過程中，變性條件的快速改變加速了部分折疊蛋白質的聚集，導致沉淀形成和非特異性的吸附，通過梯度洗脫逐步降低變性劑的濃度，使蛋白質處于一個梯度改變的變性劑條件下，控制蛋白質的折疊和聚集速度，使蛋白質在離開色譜柱時處于折疊緩沖液中，從而改善活性蛋白質的回收率。通常選擇線性的梯度用于折疊復性，對于不同的蛋白質還有其他模式，如果蛋白質在某一變性劑濃度范圍不穩定，就需要快速降低變性劑濃度以通過此區域，而不采用線性梯度。凝膠過濾復性中，梯度在上樣前就在色譜柱中已經形成，上樣後使用變性緩沖液進行洗脫，由于蛋白質受到的分子排阻比變性劑大，蛋白質移動的速度比變性劑梯度移動的速度快，最終蛋白質通過整個變性劑區，離開色譜柱時處于折疊緩沖液中。通過尿素線性梯度復性，變性溶菌?以高蛋白濃度上樣（17mg／mL）可以獲得90%的活性回收率，與稀釋復性和非梯度凝膠過濾復性相比較，顯著地改善了活性回收率。對單鏈Fv片段包含體蛋白，使用梯度同時改變變性劑濃度和pH，比單改變變性劑濃度的梯度復性或不使用梯度的凝膠過濾復性具有更高的活性得率。另外應用連續環形色譜，蛋白質樣品連續上樣于旋轉的色譜柱上，在提高折疊效率的同時，也提高了色譜復性處理的能力。