現代分子生物學技術及實驗技巧(第二版)（簡體書）

本書一版廣受讀者歡迎。新版延續第一版內容特色，系統介紹現代分子生物學各種傳統和新型的實驗技術，涵蓋核酸提取技術、目的基因的獲取及鑒定技術、載體的構建與鑒定技術、細菌轉化與細菌轉染技術、外源基因表達的鑒定技術、報告基因分析技術、差異基因表達譜分析技術、蛋白質-核酸相互作用技術、蛋白質-蛋白質相互作用技術、微生物體內同源重組技術、轉基因動物技術、基因編輯技術、微RNA的構造及實驗技術、長鏈非編碼RNA研究實驗技術、非編碼RNA數據庫及在線分析工具等。新版增加了CRISPR基因編輯技術、長鏈非編碼RNA研究實驗技術等新內容，並對非編碼RNA數據庫及在線工具一章進行重寫。和一版一樣，實驗方案部分強調對實驗結果作具體分析，每個實驗結果都附圖（照片），圖中設陰陽性對照，對照圖對實驗結果進行詳細分析，使讀者對實驗結果一目了然，還指出了每個技術的難點和解決辦法。本書是生物、醫學領域相關實驗室的案頭實驗操作工具書，可供從事生命科學研究和教育的碩士、博士等科技工作者和教學一線教師日常查閱參考。

葉棋濃，軍事科學院軍事醫學研究院某所科技委主任，研究員，博士生導師。國家杰出青年科學基金獲得者，享受國務院政府特殊津貼。中國生物工程學會副秘書長、中國生物工程學會醫學生物技術專業委員會主任委員、中國分析測試協會標記免疫分析專業委員會副主任委員。Frontiers in Cell and Developmental Biology和Frontiers in Oncology雜志副主編，Science Bulletin雜志特邀編委。主要從事腫瘤發生、侵襲、轉移、耐藥相關基因功能及機制研究，發現了新的調控重要信號轉導通路的基因和非編碼RNA，為腫瘤的診斷和治療提供候選靶標。以通訊作者在Cancer Cell、Nature Communications、Science Advances、Journal of Clinical Investigation、Advanced Science、Science Bulletin、STTT等SCI雜志上發表文章90余篇。獲北京市科學技術一等獎1項，軍隊科技進步二等獎1項。

一版廣受歡迎，新版維持一版內容特色。系統介紹現代分子生物學各種傳統和新型的實驗技術，新版增加了CRISPR基因編輯技術、長鏈非編碼RNA研究實驗技術等新內容，並對非編碼RNA數據庫及在線工具一章進行重寫。實驗方案部分強調對實驗結果作具體分析，每個實驗結果都附圖（照片），圖中設陰陽性對照，對照圖對實驗結果進行詳細分析，使讀者對實驗結果一目了然，還指出了每個技術的難點和解決辦法。分子生物學工作者案頭常備實驗手冊工具書。

分子生物學是從分子水平對生物學進行研究的科學，現代分子生物學技術的誕生使生命科學的發展得以大力推進，分子生物學技術在生物學、醫學、農林業、製藥學等多個領域得到了廣泛的應用。該技術是目前從事生命科學研究的重要手段，是每個從事這個領域的科技工作者都必須熟練掌握的基本技術。
編寫本書的目的在於彌補以往的書籍中對實驗結果分析的缺乏，本書強調對實驗結果作具體的分析，如需附結果的圖或照片，圖中要有陰陽性對照等。結合照片分析研究結果，列舉實驗中經常遇到的問題及可能的解決方法是本書的特色。讀者閱讀後在實驗結果解讀和改進實驗方法等方面都能豁然開朗。此外，本書在編寫的內容上也力求全面，第一到六章包括分子克隆所需的技術，從基因的提取、克隆到目的基因的表達；第七到十三章分別介紹了報告基因分析、差異基因表達譜分析、蛋白質與核酸/蛋白質的相互作用、微生物體內同源重組技術、基因編輯和轉基因動物等技術；最後五章則對流式細胞術、幹細胞的分離培養與誘導分化技術、微RNA、長鏈非編碼RNA，以及非編碼RNA數據庫及在線分析工具進行了介紹。本書適合所有從事生命科學研究的科技工作者、教師和研究生使用。
本書大多由工作在第一線的青年科技工作者和博士研究生撰寫，由於時間倉促，加上編者水平有限，書中難免有疏漏和不妥之處，懇請讀者指正。

葉棋濃
軍事醫學研究院生物工程研究所
2024年4月於北京

第一章分子生物學技術概述1
一、引言1
二、目的基因的獲取1
三、克隆載體的選擇2
四、載體的轉化2
五、重組子的篩選3
六、基因表達4
七、生物工程技術的應用5
參考文獻6

第二章核酸提取技術7
第一節質粒DNA的提取7
一、引言7
二、堿裂解法小量質粒提取所需的儀器、材料及基本步驟8
三、Promega質粒DNA小量提取試劑盒操作程序9
四、注意事項9
五、實驗結果說明10
六、疑難解析10
第二節基因組DNA的提取12
一、引言12
二、從植物組織提取基因組DNA13
三、從動物組織提取基因組DNA14
四、細菌基因組DNA的制備14
五、用DNA提取試劑盒從全血和組織中提取基因組DNA15
六、注意事項17
七、實驗結果說明17
八、疑難解析18
第三節RNA的提取19
一、引言19
二、實驗設計思路和基本步驟20
三、實驗結果說明24
四、疑難解析24
參考文獻25

第三章目的基因的獲取及鑒定技術26
第一節普通PCR26
一、普通PCR的基本概念和原理26
二、普通PCR技術的實驗方法27
三、疑難解析32
第二節實時熒光定量PCR33
一、實時熒光定量PCR的基本概念和原理33
二、實時熒光定量PCR的定量方法36
三、實時熒光定量PCR的實驗方法42
四、實時熒光定量PCR技術的應用47
五、疑難解析53
第三節環介導等溫擴增法快速檢測病原菌55
一、引言55
二、環介導等溫核酸擴增的原理57
三、實驗設計思路和基本步驟59
四、實驗結果66
五、疑難解析69
六、小結70
參考文獻72

第四章載體的構建和鑒定76
第一節克隆載體76
一、pBR322載體76
二、pUC8——一種Lac選擇型質粒78
三、pGEM3Z——克隆DNA的體外轉錄78
四、柯斯質粒載體78
第二節表達載體79
一、原核表達載體80
二、真核表達載體82
第三節載體構建中的關鍵工具和步驟87
一、關鍵工具87
二、常規克隆關鍵步驟89
三、同源重組克隆關鍵步驟91
第四節載體構建的應用舉例92
一、常規克隆實驗材料92
二、常規克隆實驗方法93
三、同源重組克隆實驗材料97
四、同源重組克隆實驗方法98
五、疑難問題解析100
參考文獻100

第五章細菌轉化與細胞轉染技術102
第一節細菌轉化102
一、基本原理102
二、實驗設計思路和基本步驟103
三、實驗結果及分析104
四、疑難解析104
第二節細胞轉染105
一、基本原理106
二、實驗設計和基本步驟108
三、實驗結果及分析110
四、疑難解析111
參考文獻112

第六章外源基因表達的鑒定113
第一節Northern Blot113
一、引言113
二、實驗設計思路和基本步驟113
三、實驗結果說明116
四、疑難解析117
第二節RT-PCR117
一、引言117
二、實驗設計思路和基本步驟117
三、實驗結果說明120
四、疑難解析120
第三節Western Blot121
一、引言121
二、實驗設計思路和基本步驟121
三、實驗結果說明126
四、疑難解析126
第四節ELISA127
一、引言127
二、實驗設計思路和基本步驟129
三、實驗結果說明131
四、疑難解析131
參考文獻132

第七章報告基因分析134
第一節報告基因的定義和種類134
一、報告基因的定義134
二、常用的報告基因134
第二節應用報告基因分析基因的轉錄活性135
一、實驗原理135
二、實驗設計和基本步驟136
三、實驗結果分析137
四、疑難解析140
第三節報告基因在動物活體成像中的應用140
一、實驗原理140
二、實驗設計和基本步驟142
三、實驗結果分析143
四、疑難解析143
參考文獻145

第八章差異基因表達譜分析147
第一節基於雙向電泳技術的蛋白質組學分析147
一、引言147
二、實驗基本步驟和注意事項147
三、雙向電泳實驗結果說明及疑難解析154
四、質譜數據分析說明及疑難解析154
五、結語159
第二節基因芯片160
一、引言160
二、工作原理161
第三節基因芯片的制備163
一、概述163
二、探針的選擇和制備163
三、基因芯片基片的選擇和準備165
四、基因芯片的製作166
第四節基因芯片的檢測168
一、基因芯片的雜交和數據獲取168
二、基因芯片分析常用的軟件和數據庫169
第五節基因芯片的應用170
一、基因芯片與病原微生物檢測170
二、基因芯片與腫瘤172
三、基因芯片與藥物研發174
四、結語176
參考文獻176

第九章蛋白質-核酸相互作用技術178
第一節凝膠遷移實驗178
一、引言178
二、實驗設計與基本步驟179
三、實驗舉例與結果說明184
四、需要注意的問題186
第二節染色質免疫共沉澱技術187
一、引言187
二、實驗基本步驟188
三、實驗舉例189
四、實驗注意事項192
第三節RNA沉降192
一、實驗基本原理192
二、實驗基本思路192
三、實驗舉例說明197
第四節RIP實驗198
一、實驗基本原理198
二、實驗思路199
三、注意事項200
四、實驗舉例說明201
參考文獻201

第十章蛋白質-蛋白質相互作用技術202
第一節運用酵母雙雜交技術篩選與靶蛋白相互作用的蛋白質202
一、引言202
二、實驗儀器及材料203
三、實驗設計流程204
四、實驗方法204
五、實驗結果說明210
六、疑難解析214
第二節GST沉降214
一、實驗基本原理214
二、實驗基本步驟215
三、實驗舉例217
四、實驗注意事項221
第三節免疫共沉澱222
一、引言222
二、實驗設計和基本步驟223
三、實驗結果舉例225
四、需要注意的問題227
第四節細胞共定位228
一、引言228
二、實驗設計和基本步驟228
三、實驗結果舉例說明229
四、實驗注意事項230
參考文獻231

第十一章微生物體內同源重組技術232
第一節傳統的大腸桿菌體內同源重組方法（RecA重組系統）232
一、引言232
二、利用RecA重組系統構建痢疾桿菌hns基因插入突變體232
三、RecA重組系統構建突變體的其他方法235
四、存在的問題和解決方法236
五、小結236
第二節Red/ET重組系統237
一、引言237
二、痢疾桿菌hns基因缺失突變體的構建238
三、Red同源重組技術應用策略241
四、應用Gap-Repair克隆技術構建pBR322-Red載體242
五、Red/ET重組系統的其他應用244
六、小結245
參考文獻245

第十二章轉基因動物技術247
第一節轉基因動物概述247
一、轉基因動物的概念247
二、轉基因動物的分類247
三、轉基因動物的命名248
四、轉基因動物技術的基本原理249
五、轉基因動物的安全性和倫理學問題250
六、轉基因動物技術的發展概況251
第二節顯微注射法制備轉基因動物252
一、儀器設備及材料和試劑252
二、實驗動物準備253
三、轉基因動物制備方法254
四、影響轉基因動物產生效率的因素257
第三節利用ES細胞制備轉基因動物258
一、ES細胞的研究歷史258
二、ES細胞的生物學特性258
三、ES細胞分離培養的基本方法259
四、ES細胞的遺傳修飾263
五、轉基因動物制備270
參考文獻271

第十三章基因編輯技術272
第一節基因打靶技術273
一、基因打靶技術的原理273
二、利用同源重組構建基因打靶動物模型的基本步驟273
三、基因打靶的策略276
四、基因打靶的生物學意義和應用前景287
第二節CRISPR/Cas9系統288
一、CRISPR/Cas系統的簡介及其作用原理288
二、TypeⅡ CRISPR/Cas9系統289
三、CRISPR/Cas9基因編輯技術的應用舉例291
四、CRISPR/Cas9基因編輯技術的應用前景295
第三節CRISPR/Cas13系統296
一、CRISPR/Cas13系統的介紹296
二、實驗基本步驟296
三、注意事項298
四、實驗結果說明298
五、疑難解析300
參考文獻300

第十四章流式細胞術實驗方法305
一、引言305
二、實驗方法308
三、實驗結果分析313
四、流式細胞分析的質量控制323
參考文獻325

第十五章幹細胞的分離培養與誘導分化327
第一節人胎盤來源間充質幹細胞的分離培養與純化327
一、引言327
二、材料、試劑與主要儀器設備328
三、實驗方法329
四、實驗結果332
五、注意事項337
第二節小鼠間充質幹細胞的分離培養與純化338
一、引言338
二、骨髓法339
三、密質骨法339
第三節人胚胎幹細胞的培養348
一、引言348
二、實驗材料348
三、實驗方法348
四、注意事項352
第四節CD34 造血幹細胞與CD14 單核細胞向樹突狀細胞的誘導分化353
一、引言353
二、實驗材料與方法354
三、實驗結果357
四、注意事項359
參考文獻359

第十六章微RNA的構造及實驗技術364
第一節miRNA克隆364
一、材料與設備365
二、實驗方法365
三、疑難解析368
第二節miRNA Northern Blot368
一、材料與設備368
二、實驗方法369
三、疑難解析369
第三節miRNA原位雜交370
一、材料與設備370
二、實驗方法371
三、疑難解析371
第四節基於poly（A）加尾的miRNA RT-PCR372
一、材料與設備372
二、實驗方法373
三、疑難解析374
第五節miRNA功能研究375
一、miRNA表達檢測375
二、miRNA功能篩選鑒定376
三、miRNA靶基因鑒定377
四、miRNA非經典功能378
第六節siRNA的構造及實驗研究379
一、引言379
二、如何進行RNAi實驗381
三、常用RNAi實驗的基本步驟384
四、實驗結果說明388
五、疑難解析389
參考文獻390

第十七章長鏈非編碼RNA研究實驗技術392
第一節lncRNA克隆392
一、材料與設備393
二、實驗方法393
三、實驗注意事項396
第二節lncRNA Northern Blot396
一、材料與設備396
二、實驗方法396
三、實驗注意事項397
第三節lncRNA原位雜交398
一、材料與設備398
二、實驗方法398
三、實驗注意事項399
第四節lncRNA定量檢測400
一、材料與設備400
二、實驗方法400
三、實驗注意事項400
第五節lncRNA-蛋白質互作研究技術401
一、RNA pull-down鑒定特定lncRNA結合的蛋白質401
二、RIP鑒定特定蛋白質結合的lncRNA免疫沉澱技術404
三、CLIP鑒定蛋白質與lncRNA的結合位點405
四、ChIRP鑒定與lncRNA結合的蛋白質/DNA408
參考文獻412

第十八章非編碼RNA數據庫及在線分析工具介紹414
第一節綜合性非編碼RNA數據庫414
一、概論414
二、非編碼RNA相關數據庫415
三、小結425
第二節miRNA相關數據庫及預測工具425
一、概論425
二、miRNA相關數據庫425
三、miRNA相關預測工具434
四、小結442
第三節rRNA相關數據庫及預測工具442
一、概述442
二、rRNA相關數據庫442
三、rRNA相關預測工具448
四、小結449
第四節sRNA相關數據庫及預測工具450
一、概述450
二、sRNA相關數據庫450
三、sRNA靶標相關預測工具452
四、小結454
第五節siRNA相關數據庫454
一、概述454
二、siRNA相關數據庫454
第六節tRNA相關數據庫及預測工具460
一、概述460
二、tRNA相關數據庫460
三、tRNA相關預測工具470
四、小結472
第七節snoRNA相關數據庫及預測工具472
一、概述472
二、snoRNA相關數據庫472
三、snoRNA相關預測工具473
四、小結476
第八節lncRNA及circRNA相關數據庫477
一、概論477
二、lncRNA及circRNA相關數據庫477
三、小結497
參考文獻498