生化分析技術實驗（簡體書）

《生化分析技術實驗》可供高等院校生命科學、生物技術專業學生使用，亦可用于生物制藥、食品、藥品、醫學、臨床檢驗、環境監測等學科的本科生和研究生實驗教學，并可以作為相關生物制藥企業等社會研究和應用部門的實驗技術參考書。

叢書序
叢書前言
前言
一 基礎實驗部分
實驗1紫外分光光度法（測定蛋白質吸收光譜曲線及含量）
實驗2熒光光度測定法（測定核黃素含量）
實驗3離子交換層析（分離氨基酸）
實驗4凝膠層析（分離蛋白質及相對分子質量測定）
實驗5 DEAE—纖維素梯度洗脫層析
實驗6疏水層析
實驗7親和層析分離純化胰蛋白酶（環氧氯丙烷活化法_）
實驗8金屬螯合層析
實驗9反相層析
實驗10聚焦層析
實驗11吸附層析（羥基磷灰石柱層析分離純化DNA）
實驗12單向火箭免疫電泳
實驗13聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳
實驗14 SDS—聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（不連續體系）
實驗15 Tricine—SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離小分子多肽）
實驗16管式凝膠等電聚焦
實驗17水平平板凝膠等電聚焦
實驗18潛水式瓊脂糖凝膠電泳
實驗19印跡轉移電泳
實驗20酶聯免疫吸附測定
二 綜合實驗部分
實驗21蔗糖酶的綜合分離純化及其性質鑒定
實驗22親和層析分離純化尿激酶及其性質鑒定（溴化氰活化法）
實驗23雙向電泳（雙向電泳比較FADD和FADD— —細胞株的蛋白質表達差異）
實驗24基因融合蛋白質的純化
三 附 錄
附錄A聚丙烯酰胺凝膠電泳的蛋白質銀染色法
附錄8常用緩沖液的配制方法
附錄C常用數據
主要參考文獻

6.5 實驗步驟
6.5.1苯基瓊脂糖（phenyl sepharose 4B）凝膠的處理
商品化的phenyl sepharose 48凝膠顆粒保存在20％的乙醇溶液中，使用時取適量體積的凝膠在砂芯漏斗中用大于10倍凝膠體積的蒸餾水充分抽濾清洗，然后將洗凈的凝膠轉移到含有Buffer A的燒杯中。
6.5.2裝柱
（1）選擇層析柱，觀察柱底端濾芯是否完好，將選擇的層析柱垂直裝好在臺式鐵架上，關閉柱底端出口，在柱內注入少許（約1.0cm高）Buffer A平衡緩沖液。
（2）將燒杯中已處理好的phenyl sepharose 48凝膠，加適量的Buffer A攪成懸浮狀，然后沿著貼緊柱內壁的玻璃棒，沿柱內壁細心加入，倒人時不要太快，以免產生泡沫和氣泡。
（3）待凝膠在柱底部有明顯沉積后（約10min），慢慢打開柱底端出口，用吸管吸去柱內上層過多的平衡液，繼續向柱內加入懸浮的凝膠直至沉積后柱床體高度為3.0cm為止。此時柱床表面之上應留有一定高度（約2cm）的溶液，關閉柱底端出口。
（4）在裝柱時要避免使柱內液體流干而使裝柱失敗。另外凝膠懸浮液的溫度要相對恒定或應與室溫接近，否則柱床體內易產生氣泡而影響層析效果。
（5）檢查層析柱是否裝好。裝好的層析柱應該沒有“紋路”、節痕和氣泡，并且柱床體表面平整而均勻。這樣方可投入使用，否則需要重新裝柱直至達到要求為止。
（6）連接并調試恒流泵（流速0.5mL／min）、紫外檢測儀、色譜工作站、計算機、部分收集器（8min／管）等裝置，使整個系統處于工作準備狀態。
6.5.3平衡
用5倍柱床體積的Buffer A初始平衡緩沖液，以0.5mL／min的流速，平衡約30min。平衡快結束時觀察儀器穩定后，重新調節紫外檢測儀的光吸收A280nm零點至色譜工作站的記錄基線。平衡結束后關閉柱底端出口。
6.5.4加樣
（1）移去層析柱上端柱塞，打開層析柱底端出口，小心使層析柱內液體流至層析柱床表面時即關閉。
（2）用自動取液器吸取樣液1.0mL沿柱內壁緩慢加入柱中，加樣時注意避免沖壞柱床表面。加樣完畢后，在啟動部分收集器（4mL／管）和色譜工作站記錄軟件記錄的同時，慢慢打開層析柱底端出口，使液面流至與柱床表面相平時即關閉。
6.5.5清洗柱內壁
用自動吸管（或滴管）吸取適量（約1mL）Buffer A平衡緩沖液，重復上樣方法反復清洗層析柱內壁四周2～3次，每次清洗均需將液面降至柱床表面，并防止沖壞柱床表面，當最后一次清洗平衡緩沖液液面流至與柱床表面相平時即關閉柱底端出口，然后加入3.0cm高Buffer A平衡緩沖液。
6.5.6洗滌
接上恒流泵，打開層析柱底端出口，以0.5mL／min的流速，繼續用Buffer A平衡緩沖液（約5倍柱床體積）洗滌直至穿過峰（第一個小峰）回到紫外檢測儀在色譜工作站上記錄的基線，并穩定約10min后為止。關閉恒流泵，關閉層析柱底端出口。
6.5.7階段洗脫
1）用Buffer B洗脫緩沖液階段洗脫HIC柱
階段（或分步）洗脫就是相繼（或突然）改變洗脫條件的一種柱層析洗脫方式。階段洗脫的方法是：在各步驟更換洗脫液之間，應注意先將柱內液面降至柱床面后再在柱內加入2～3cm高的下一步驟溶液進行階段洗脫。